褪黑素對糖尿病大鼠非酶糖基化產物及受體表達和心臟功能變化的影響

崔剛 張東東 韓雪 孫權

(1佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；2保山中醫藥高等專科學校)

糖尿病心肌病(DCM)由Hamby等〔1〕于1974年首次提出，是一種糖尿病患者特殊的心肌病變，由糖尿病繼發而來，且獨立于冠心病和高血壓之外，以心肌能量代謝或結構異常改變導致心肌細胞重塑，通過影響心肌細胞重塑最終引起心臟收縮舒張功能障礙〔2〕。DCM臨床發病率高，危害大，現公認為常見和嚴重的糖尿病慢性并發癥之一，成為現今研究的熱點〔3，4〕。研究表明，沉積于心血管組織，由蛋白質和殘留糖發生非酶化反應生成的糖基化終末產物(AGEs)在糖尿病心肌纖維化的發生發展中極其重要〔5〕。AGEs 可與其受體(RAGE)結合并激活一系列信號轉導通路進而誘導成纖維細胞增殖〔6〕。作為免疫球蛋白超蛋白的一種細胞表面分子，RAGE與其他受體存在明顯不同。一般受體會受到增加的配體水平的反饋性抑制，而RAGE 則會因為配體水平的升高增加其表達〔7〕。褪黑素(MT)屬于吲哚類激素，由松果體分泌，對人類的睡眠、生殖及晝夜節律等起到調節作用，對機體的神經、內分泌和免疫系統均有影響。研究證實MT對糖尿病并發癥具有良好的干預作用，并已試用于糖尿病腎病的治療〔8〕。本研究探討MT對DCM大鼠心臟的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1模型建立和分組 80只Wistar大鼠清潔級雄性(長春億斯實驗動物技術有限責任公司)，體重200～220 g，分籠飼養于佳木斯大學動物實驗中心，自由攝食和飲水，每天光照12 h。隨機分為正常組、模型組、MT低劑量組和MT高劑量組，每組20只，分籠飼養。除正常組外，其余3組都給予高脂高糖飲食4 w。大鼠禁食12 h，腹腔內(按50 mg/kg體重)注射1%鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)。給藥后72 h尾靜脈采血，空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。實驗時每4 w檢測血糖一次。造模后每天10∶00至14∶00 MT(浙江延年褪黑素公司)灌胃一次，MT低劑量組劑量為10 mg/kg體重，MT高劑量組劑量為20 mg/kg體重，正常組和模型組同等劑量生理鹽水灌胃。持續給藥16 w。

1.2血糖值測定和計算心臟指數 給藥前、后，測量前禁食、水12 h，尾靜脈采血，血糖儀測量血糖值。分別檢測大鼠空腹血糖。大鼠血流動力學指標檢測之后，每組部分大鼠沿心底大血管根部剪下心臟，生理鹽水沖洗，濾紙吸干，精確稱量心臟質量，心臟指數=心臟質量/體質量，稱量后迅速將心臟放進-80℃冰箱凍存。

1.3心臟功能指標檢測 10%水合氯醛0.03 ml/kg體重腹腔注射麻醉大鼠，固定在大鼠用手術臺上，用彎剪剪去下頜骨至鎖骨范圍的毛。用1 ml注射器向右頸總動脈內注射500 U/kg體重肝素，并在生理記錄儀的插管內注滿肝素。依次切開皮膚、筋膜，暴露氣管，用玻璃分針游離右側頸總動脈，分離注意避免傷及神經。結扎右側頸總動脈遠心端，近心端留手術線備用，用動脈夾夾閉右頸總動脈近心端，靠近遠心端剪一斜口(血管不剪斷)，插入生理記錄儀插管，動脈夾放開一下，血管充盈，將插管向心臟方向插入1 cm，用手術線扎好(松緊適宜)，放開動脈夾，將插管螺旋插入4～5 cm，觀察生理記錄儀讀數，舒張壓為0 mmHg即插入左心室。使用生理記錄儀，測量左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期末壓(LVEDP)、室內壓最大上升速率(+dp/dtmax)、室內壓最大下降速率(-dp/dtmax)和室內壓上升達最大速率所需時間(t-dp/dt)等心功能指標。

1.4收集標本 斷髓法處死實驗大鼠，剪開胸骨，打開胸腔，暴露心臟。沿著心底大血管的根部剪斷心臟，剖開右心耳，由左心室進針用200 ml左右生理鹽水沖洗，當右心耳流出無色液體時可以停止沖洗，再用4%多聚甲醛溶液進行心臟固定，游離心臟放入10%中性甲醛溶液內浸泡后將組織制成5 μm厚石蠟切片。

1.5HE染色 ①脫蠟至水;②蘇木素染色6 min，蒸餾水沖洗5 min;③1%鹽酸-乙醇分化30 s，再次蒸餾水沖洗5 min;④伊紅染色3 min，蒸餾水沖洗5 min;⑤脫水透明;⑥中性樹膠封片;⑦顯微鏡下組織學觀察并拍照。

1.6免疫組化染色 ①烤片30 min;②脫蠟脫水后將切片放入盛有Tris鹽酸緩沖液(TBS)的抗原熱修復盒中，放入微波爐中加熱至煮沸，20 min后取出，自然冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，各5 min;③5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，37℃，20 min;④一抗(RAGE濃度為1∶50，AGE濃度為1∶100)，4℃過夜;⑤復溫至室溫，PBS洗3次，各5 min;⑥試劑Ⅰ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min。試劑Ⅱ，37℃ 20 min，PBS洗3次，各5 min;⑦二氨基聯苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察，隨時中斷，蒸餾水洗3次，各3 min;⑧蘇木素染色片刻，1%HCl-酒精分化30 s，蒸餾水洗3次，各5 min，自來水沖洗2 h(AGE染色時，省略此步);⑨脫水透明;⑩中性樹膠進行封片;圖像采集分析采用BI200軟件。所得的IOD數值越大，AGE與RAGE蛋白的表達越差；數值越小，AGE與RAGE蛋白的表達越好。

1.7統計學處理 使用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1精神狀態 正常組狀態活潑，每日進食量和飲水量穩定，體重隨周齡增加而平穩增加，眼睛有神發亮，行為動作反應快速，常出現打鬧現象，皮毛光滑有光澤，鼠尾色澤紅潤，大、小便正常。模型組狀態萎靡，每日進食量和飲水量增多、過頻；體重增加隨周齡增加而遲緩，有的甚至出現停滯；反應速度有些遲鈍，出現抱團扎堆現象，皮毛暗淡不平順、無光澤，眼神目光呆滯，鼠尾顏色發白，小便過頻、大便時干時稀不規律。MT低劑量組和MT高劑量組精神狀態尚可，每日進食量和飲水量趨于正常，體重增加緩慢，隨周齡增長增加緩慢；日常活動略有增加，但動作略有遲緩；皮毛略有柔順、光澤，眼睛發灰，略顯呆滯，鼠尾毛色略有光澤，大便略稀，小便趨于正常。

2.2血糖、體重和心臟指數 MT處理16 w后，與正常組比較，模型組、MT低劑量組和MT高劑量組血糖和心臟指數明顯升高(P<0.05)，模型組和MT低、高劑量組體重顯著降低(P<0.05);與模型組比較，MT低劑量組和MT高劑量組血糖值略降低，心臟指數略升高，但無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組空腹血糖值、體重及心臟指數

2.3心臟功能 與正常組比較，模型組心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低、t-dp/dt升高，差異具有顯著性(P<0.05)；MT低、高劑量組心功能LVSP、LVEDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、t-dp/dt差異不顯著(P>0.05)；與模型組比較，MT低、高劑量組LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax和-dp/dtmax升高、t-dp/dt降低，差異具有顯著性(P<0.05)，MT低、高劑量組差異不顯著(P>0.05)。見表2。

表2 各組心功能指標比較

2.4心肌HE染色結果 正常組心肌細胞體積正常，排列整齊，心肌各層均勻，結構清晰；胞質清澈，胞質顏色正常；心肌細胞核圓形或橢圓形，染色質分布均勻。模型組心肌細胞體積明顯增大，排列紊亂、腫脹，心肌各層次不均，結構不清；胞質渾濁，胞質顏色變淺；細胞核呈長桿狀，核固縮，核膜皺縮，出現雙核，排列紊亂，染色質邊聚于核膜下呈顆粒狀。MT低劑量組和MT高劑量組心肌細胞體積略小，排列趨于整齊，心肌各層次結構和心肌細胞間隙略清晰可以辨認；胞質略有渾濁，顏色略淺，細胞核形態趨于正常的圓形或橢圓形，染色質均勻可見。MT低劑量組較MT高劑量組更明顯(圖1)。

圖1 各組心肌HE染色(×400)

2.5心肌AGE和RAGE蛋白表達 AGE蛋白棕黃色陽性表達見于心肌細胞胞質或心肌細胞間質內，RAGE蛋白棕黃色陽性表達多見于心肌細胞膜上。處理16 w后，與模型組比較，MT低劑量組和MT高劑量組AGE、RAGE蛋白表達IOD值明顯升高(P<0.05)；與正常組比較，MT低劑量組和MT高劑量組AGE和RAGE蛋白表達差異不顯著(P>0.05)(表3和圖2)。

表3 各組心肌組織中AGE和RAGE蛋白表達

圖2 各組心肌中AGE、RAGE蛋白免疫組化(×400)

3 討 論

生理狀態下，人和哺乳動物血清中MT的含量隨著晝夜交替，呈節律性的波動，其分泌量表現為，夜間比白天要高出5～10倍，正常情況下，凌晨2∶00～3∶00達到分泌量最高值。研究表明，MT對糖尿病大鼠血糖的影響有兩種觀點：①MT可以通過改善胰島素抵抗程度〔10〕和調控胰島β細胞胰島素的分泌釋放〔11，12〕，影響機體胰島素的代謝，并能促進細胞對葡萄糖的利用，從而影響機體的血糖代謝，直接降低糖尿病大鼠血清中的血糖水平；②也有報道〔13〕顯示MT對血糖水平沒有影響，研究者認為這可能由實驗過程中給藥時間、給藥方式和給藥劑量不同等所致。

隨著糖尿病進展，高血糖可導致心臟膠原沉積誘發心肌間質纖維化，還可提高AGEs含量，提高心肌硬度〔14〕。研究表明，STZ誘導的糖尿病大鼠8～12 w心肌細胞超微結構發生改變，6～14 w發生心功能下降〔15〕。本實驗提示糖尿病大鼠心肌形態改變、收縮和舒張功能下降。而使用MT進行處理的糖尿病大鼠心肌形態得到明顯改善，心功能各項指標也得到了很好的控制。

在糖尿病的微血管并發癥中，RAGE信號通路扮演著重要角色〔16〕。AGE廣泛存在于機體的血液及各種組織、細胞中，AGE作用廣泛，通過兩種途徑發揮其生物學效應：①直接途徑，直接修飾改變蛋白質、脂質和核酸等的空間結構和功能，造成機體損傷；②間接途徑，AGE與特異性受體RAGE結合后，導致機體發生病理性改變，可激活多個細胞內信號轉導通路，可誘導生成氧自由基及滅活一氧化氮(NO)等，參與不同類型細胞的氧化應激反應、炎性反應和血栓形成的過程〔17〕。高血糖狀態下，蛋白質發生糖基化后，氧自由基生成也隨之增加，并促進AGE形成，從而導致惡性循環〔16〕。AGE生成具有不可逆性，即使糾正了高血糖，AGE也不能降至正常水平，且可在組織中繼續不斷地累積。因此，AGE在DM并發癥發生和發展全過程中起到重要作用。

RAGE廣泛存在于人體各類細胞中，屬于多配體受體，不僅參與內體炎癥反應，還與糖尿病慢性并發癥的發生、發展有關。RAGE與AGE結合后，激活相關信號反應，使內質網膜電位去極化和減少糖原合成酶激酶(GSK)-3β磷酸化，導致細胞功能障礙。糖尿病可以引起心房重構，擾亂心房內傳導系統，是房顫的危險因素之一。AGE與RAGE的結合與DCM發生密切相關，阻斷兩者的結合可能會成為預防和治療DCM的新靶點〔18，19〕。綜上，MT可抑制糖尿病大鼠AGE和RAGE蛋白間的相互影響，從而減輕DCM時的心肌損傷程度，延緩病程。

致謝：黑龍江省北藥與功能食品優勢特色學科建設項目的支持。