雌激素對人肝癌細胞增殖和凋亡的影響

周姝 白冰 張宗敏 徐靖宇 金海

(遵義醫科大學附屬醫院 1腎病風濕科，貴州 遵義 563000；2綜合病房；3消化內科)

原發性肝癌(PLC)是常見惡性腫瘤之一，2015年我國癌癥中心數據顯示，PLC是60歲以下男性最常見和病死率最高的癌癥〔1〕。近90% 的PLC為肝細胞性肝癌，其惡性程度高、病情發展快，其發病率及死亡率均呈逐年上升趨勢，嚴重威脅民眾的生命健康〔2〕。研究發現，PLC的發生及預后均與患者性別存在相關性，肝癌男性的發病率明顯高于女性，且女性患者的預后相對較好〔3,4〕，另有研究證實，雌激素受體(ERs)在肝癌組織中異常高表達〔5〕。以上研究均提示肝癌的發生、發展可能與雌激素相關，但其相關分子機制至今仍未完全闡明，探究雌激素在肝癌疾病發生和疾病進展中的潛在分子機制是目前腫瘤研究領域的熱點之一。本研究旨在探究雌激素對肝細胞癌細胞增殖和凋亡的影響，以期為雌激素抗肝癌治療提供新的基礎研究數據。

1 材料與方法

1.1細胞培養 人肝癌細胞株SMMC7721、HepG2、Bel-7404、huh7、MHCC-97L、MHCC-97H、PLC、LM3、SK-HEP-1、Bel-7402(中國科學技術研究院上海細胞庫)，采用DMEM完全培養基(含10%胎牛血清)，培養于5% CO2恒溫、飽和濕度的細胞培養箱，以細胞復蘇后4代以后的細胞為研究對象。

1.2瓊脂糖凝膠電泳 Trizol溶液提取細胞內總RNA，微量紫外熒光分光光度計檢測RNA濃度和純度(OD260/OD280)。逆轉錄試劑盒，50℃，15 min；85℃，2 min，將RNA逆轉錄為cDNA，產物置于-20℃冰箱保存。以cDNA為模板，采用ERα和ERβ特異性引物，引物序列如下，ERα正向引物5′-CAG GCT TTG TGG ATT TGA CC-3′，ERα反向引物5′-AGA GAC TTC AGG GTG CTG GA-3′，擴增長度313 bp；ERβ正向引物5′-AGG CTG CGA GAA ATA ACT GC-3′，ERβ反向引物5′-GCA AGA AGA GGC ACA AA GGT-3′，擴增長度320 bp；進行聚合酶鏈反應(PCR)，PCR產物置于-20℃冰箱保存。

Tris-硼酸(TBE)緩沖液(1×)制備2%瓊脂糖凝膠，加入適量的凝膠紅，取PCR產物與上樣緩沖液混勻后，上樣，15 V/cm電泳25 min，凝膠成像儀上觀察電泳結果，采集圖像。

1.3Western印跡 收集細胞沉淀，加入RIPA細胞裂解液，冰上孵育30 min，4℃條件下12 000 r/min離心20 min，收集上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒檢測蛋白濃度；十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白后，轉移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫孵育1 h后，分別加入兔抗人ERα和ERβ一抗工作液(稀釋比例1∶1 000，美國Abcam公司)，4℃孵育過夜，含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBS-T)洗滌3次后，分別加入鼠抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗工作液(稀釋比例1∶5 000，北京博奧森生物技術有限公司)，4℃孵育40 min，PBS-T洗滌3次后，電化學發光(ECL)液顯色反應，采集圖像。

1.4四唑鹽(MTT)實驗 將處于對數生長期的細胞，制備成細胞懸液(約1×105個/ml)，取100 μl細胞懸液，接種于96孔板中，每組設置4個平行復孔，孵育16～24 h后，棄去舊培養液，每組加入100 μl含有不同濃度雌激素(0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L)的完全培養液，培養24 h、48 h、72 h后，棄上清，每孔加入100 μl MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h，酶標儀490 nm處檢測吸光度值(OD490)。細胞增殖抑制率(IR)=(OD空白對照組-OD雌激素組)/OD空白對照組×100%。

1.5細胞凋亡實驗

1.5.1Tunel染色實驗 將處于對數生長期的細胞，制備成細胞懸液(約2×105個/ml)，取1.5 ml細胞懸液，接種于6孔板中，孵育16～24 h后，棄去舊培養液，每組加入100 μl含有不同濃度雌激素(0、10 μmol/L)的完全培養液，培養48 h后，棄上清棄去舊培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞1次，4%多聚甲醛固定細胞30～60 min，PBS洗滌細胞1次，加入Triton-100細胞裂解液(0.1%)，冰上孵育2 min，PBS洗滌細胞2次，加入Tunel染色液，避光孵育30 min，PBS洗滌細胞3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照，并對陽性染色細胞(即凋亡細胞)和總細胞進行計數，計算凋亡細胞占總細胞數的百分比。

1.5.2膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染實驗 將處于對數生長期的細胞，制備成細胞懸液(約2×105個/ml)，取1.5 ml細胞懸液，接種于6孔板中，孵育16～24 h后，棄去舊培養液，每組加入100 μl含有不同濃度雌激素(0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L)的完全培養液，培養24 h、48 h后，棄上清，0.25%胰酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化后，收集細胞懸液，PBS緩沖液洗滌細胞1次，加入300 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，再加入5 μl的PI染色，室溫孵育5 min，30 min內進行流式檢測，收集流式細胞術直方圖并進行結果統計。

1.6基因芯片技術 將處于對數生長期的細胞，制備成細胞懸液(約2×105個/ml)，取3.0 ml細胞懸液，接種于6 cm培養皿中，孵育16～24 h后，棄去舊培養液，每組加入3.0 ml含有不同濃度雌激素(0、20 μmol/L)的完全培養液，培養48 h后，收集細胞。采用RNA試劑盒，提取細胞總RNA，RNA純化試劑盒進行純化，微量紫外分光光度計檢測RNA純度及濃度，進行RT2 Profiler PCR Arrays基因表達分析。

1.7統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行雙尾t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1ER在人肝細胞癌中的表達 ERα和ERβ的mRNA、蛋白在人肝細胞癌細胞SMMC7721、HepG2、Bcl-7404、huh7、MHCC-97L、MHCC-97H、PLC、LM3、SK-HEP-1、Bcl-7402中均有表達，見圖1、圖2。

圖1 ERα和ERβ擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 ERα和ERβ蛋白的Western印跡顯影

2.2不同濃度雌激素對人肝細胞癌增殖的影響 不同濃度雌激素分別處理SMMC7721、HepG2細胞24 h、48 h、72 h后，SMMC7721、HepG2細胞增殖均有不同程度的抑制，相同處理時間時及雌激素濃度增加，細胞增殖抑制率增高；相同雌激素濃度時，隨著處理時間延長，細胞增殖抑制率呈增高趨勢。見表1、表2和圖2。

表1 不同濃度雌激素作用不同時間對SMMC-7721細胞增殖的影響

表2 不同濃度雌激素作用不同時間對HepG2細胞增殖的影響

2.3不同濃度雌激素對人肝細胞癌凋亡的影響

2.3.1Tunel法檢測雌激素對HepG2和SMMC-7721細胞晚期凋亡的影響 0.00、10.00 μmol/L雌激素處理HepG2和SMMC-7721細胞48 h后，空白組細胞數量較多，其間極少量散在分布的Tunel染色陽性細胞；雌激素組細胞數量明顯減少，形態明顯發生變化(形態變為梭形或多角形)，細胞皺縮(體積明顯縮小)，其間到處可見胞核及核周呈棕褐色即Tunel染色陽性的凋亡細胞或濃染的凋亡小體，細胞晚期凋亡率顯著增加，見圖3、表3。

表3 雌激素對Hep2G和SMMC7721晚期凋亡率的影響

2.3.2流式細胞儀檢測雌激素對HepG2和SMMC-7721細胞凋亡的影響 與0.00 μmol/L濃度相比，1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L濃度雌激素均可誘導HepG2和SMMC-7721細胞凋亡，相同處理時間時，隨著雌激素濃度增加，細胞凋亡率增高；相同雌激素濃度時，隨著處理時間延長，細胞凋亡率增高；見表4。

表4 不同濃度雌激素作用不同時間對HepG2、SMMC7721細胞凋亡率的影響

2.4雌激素對肝細胞癌細胞凋亡相關蛋白的影響 與0.00 μmol/L相比，20.00 μmol/L雌激素處理SMMC-7721細胞48 h后，BRI1相關受體激酶(BAK1)〔(5.0±0.42)μmol/L〕、生長停滯和DNA損傷誘導蛋白(GADD45A)〔(5.4±0.71)μmol/L〕、HRK〔(4.03±0.53)μmol/L〕、淋巴毒素-α(LTA)〔(5.13±0.60)μmol/L〕、腫瘤壞死因子受體超家族成員10A(TNFRSF-10A)〔(4.29±0.41)μmol/L〕基因表達上調。

3 討 論

肝癌是我國高發的、危害極大的惡性腫瘤，我國的肝癌患者約占全世界肝癌的50%，肝癌在各年齡段均有發生，但多見于中老年患者，近年來有年輕化的趨勢〔6〕。盡管目前治療肝癌的方法眾多，但療效依然有待提高，患者的預后不容樂觀，因此探究新的治療策略尤為重要。據流行病學統計，我國肝癌的年均發病率男性為39.42/10萬人，女性為13.63/10萬人，而年均死亡率男性為36.41/10萬人，女性13.37/10萬人，由此可見女性的肝癌發病率明顯低于男性，且生存情況優于男性，可見性別對肝癌的發生、發展有一定影響〔7〕。此外，ER基因ESR1的基因多態性與乙型肝炎病毒的慢性感染相關〔8〕。因此可以推測，性別差異導致肝癌發病率的差異可能與性激素，主要是雌激素有關。

雌激素是具有廣泛生物活性的類固醇激素，包括雌二醇、雌三醇及雌酮等，主要由卵巢和胎盤分泌，在肝臟、脂肪和腎上腺皮質等外周組織中也有生成〔9，10〕；雌激素不僅可以促進生殖器官成熟，而且也參與了個體正常生長發育，與多種生理病理過程相關〔11〕。雌激素主要通過ER相關信號通路發揮生理功能。ER包括經典的核受體和膜受體兩大類，包括ERα、ERβ兩種亞型，二者的結構相似，但在組織分布和表達量方面則隨性別、年齡有所區別；ERα、ERβ在不同組織中的含量及生物功能也有不同，而在消化系統中，ERα主要分布于肝臟〔12〕，ERβ主要分布于胃腸道〔13〕。雌激素對肝臟形態的建成、功能發揮重要作用，此外，肝臟也是性激素代謝轉化的重要器官，芳香化酶可將雌激素轉化為雌三醇和雌酮〔14〕；同時，肝臟是激素敏感性器官，雌激素比例失衡可能是誘導肝癌的因素之一，ER在肝癌組織中呈高表達狀態，因此ER有可能作為肝癌的重要診斷指標〔15〕。本研究采用普通PCR技術檢測到ERα和ERβ mRNA在肝癌細胞株均有表達，同時Western印跡實驗結果發現，ERα和ERβ蛋白質在肝癌細胞中均有表達。

腫瘤細胞增殖與凋亡失衡決定了腫瘤的生長速率。細胞凋亡即細胞程序性死亡，其在維持機體正常生長發育、維持機體內環境穩態方面發揮重要作用；誘導腫瘤細胞凋亡是當前抗腫瘤藥研發的重要策略之一。Leitman等〔16〕在小鼠模型的研究發現，雌激素參與肝組織中一些基因調控，主要體現在肝細胞增殖的相關基因，因此本研究主要關注雌激素在肝細胞癌增殖和凋亡中的作用。本研究采用不同濃度雌激素處理人肝細胞癌細胞，不同濃度雌激素對肝癌細胞增殖均有不同程度抑制作用，且具有時間和劑量的依賴性；雌激素處理肝細胞癌細胞(SMMC7721、HepG2)，細胞晚期凋亡率及細胞儀Annexin V-FITC/PI實驗結果顯示，不同濃度總凋亡率增高，且存在時間劑量依賴性。以上實驗結果均表明，雌激素可抑制肝癌細胞增殖、誘導細胞凋亡，提示雌激素具有抗肝癌功能。白細胞介素(IL)-6是重要的炎癥因子，可起到促進肝癌細胞的增殖、侵襲和轉移的作用，而雌激素是IL-6的有效抑制因子，生理劑量的雌激素即可明顯減少IL-6的釋放〔17〕；Wang等〔18〕的研究顯示，雷洛昔芬(ER調節劑)可通過抑制IL-6/信號傳導與轉錄激活因子(STAT)3信號傳導促進肝癌細胞凋亡。另有研究顯示，雌激素可通過調控核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3來抑制肝癌細胞增殖、遷移和集落形成能力〔19〕。

Kao等〔20〕研究發現，雌激素對肝臟的影響主要體現在轉錄水平；本研究基因芯片技術檢測細胞中84個凋亡相關基因的表達變化，提示雌激素抑制肝癌細胞增殖、誘導細胞凋亡，可能與上調這些基因表達相關，但其誘導細胞凋亡的具體機制，有待在以后的實驗中進一步完善。

綜上所述，人肝癌細胞中存在ER表達，且雌激素能夠抑制肝癌細胞增殖、誘導肝癌細胞凋亡。然而目前雌激素及其受體抑制肝癌發生、發展的具體作用機制尚未完全闡明，雌激素治療仍存在爭議，仍需進一步研究探索。