Nanog蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達及發酵優化

李正杰，顧正華，石貴陽，李由然，辛瑜,2，張梁*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214000)2(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214000)

Nanog是2003年被發現對維持胚胎干細胞自我更新和多能性起關鍵作用的一個基因[1]，能夠獨立于 LlF/Stats途徑維持內細胞團(inner cell mass, ICM)和胚胎干細胞的多能性[2]。它通過轉錄來調節人類胚胎干細胞的S期，從而維持胚胎干細胞自我更新的功能。Nanog屬于ANTP 類 NK(natural killer)家族基因，定位于人的12號染色體 12p13上[3-4]。對Nanog的功能，與疾病之間的關系以及腫瘤作用機理等問題的研究在臨床疾病控制與治療方面都有重要意義[5-7]，Nanog的表達很大程度上被認為是人類的內部細胞團胚泡未分化程度高的表現[8]。另外Nanog對于細胞由去分化的中間體過渡到基態多能性來說是必不可少的[9]，Nanog蛋白在上皮間質轉化中也起著重要作用[10]。近年來，隨著研究Nanog基因及其蛋白的功能、作用機制以及與其他因子或信號的相互關系日益增多，對Nanog蛋白及多克隆抗體的需求量也越來越大。

長期以來Nanog蛋白主要通過從動物細胞中分離提取，其缺點在于過程繁瑣且產率低。李軍等[11]通過大腸桿菌成功實現了小鼠來源的Nanog蛋白表達，但產物為包涵體;張經余等[12]通過大腸桿菌實現了人源Nanog假基因NanogP8蛋白的原核表達，產物也為包涵體，目前雖然存在市售人源Nanog蛋白，但并無人源Nanog蛋白原核表達的相關實驗研究報道，且市售人源Nanog蛋白價格昂貴，如艾博抗公司的5 μgNanog蛋白售價為1 595元。因此，為了降低人源Nanog蛋白的成本，滿足醫學實驗研究，也方便后續大量制備Nanog多克隆抗體，本研究通過構建pET32a-Nanog重組質粒并轉入到大腸桿菌中，實現人源Nanog蛋白與硫氧還蛋白的可溶性融合表達，最終經腸激酶酶切后得到Nanog蛋白。搖瓶優化誘導溫度、誘導劑含量及不同補料碳源，并在15 L發酵罐上以分批-補料發酵的形式考察不同溶氧水平、溫度控制方式對菌體產蛋白的影響，為進一步大規模制備Nanog蛋白及多克隆抗體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、載體pET32a(+)和pMD19-T Simple Vector均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑與培養基

種子培養基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，115 ℃滅菌20 min。

斜面保藏培養基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10、瓊脂15～20，115 ℃滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨12、酵母粉24、K2HPO43、MgSO4·7H2O 0.8、(NH4)2SO45，115 ℃滅菌20 min。

補料培養基：質量分數為35%的甘油溶液。

試劑：TaqDNA聚合酶、限制性內切酶，加拿大Fermentas 公司；酵母膏、胰蛋白胨、質粒小量提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒，北京博大泰克生物技術公司；氨芐霉素、兔抗Nanog多克隆抗體及羊抗兔的二抗、核糖核酸酶(Ribonuclease)，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器與設備

BoltTMMini Gel Tank、iBlotTM2 Gel Transfer Device、iBindTMWestern Systern，美國Thermo Fisher Scientific公司；SCG蛋白純化系統，蘇州賽譜儀器有限公司；S100D型PCR儀，美國BIO-RAD公司；CF16RX Ⅱ冷凍離心機，日本HITACHI公司；V-1200分光光度計，上海美譜達儀器公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海民儀電子有限公司；HYL-C型組合式搖床，太倉市實驗設備廠；T&J Atype 15 L發酵罐，上海迪必爾生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組大腸桿菌表達質粒的構建

NCBI數據庫中查詢得到人源Nanog基因序列(GenBanK：AY230262.1)，基于大腸桿菌偏好性完成密碼子優化，由生工生物工程(上海)有限公司合成。以合成的Nanog基因為模版設計引物P1(5-CGGAATTCATGAGTGTGGATCCAGCTTG-3)，P2(5-CCC-TCGAGCACGTCTTCAGGTTGCATGT-3)，進行PCR擴增，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，30個循環，16 ℃保溫10 min。然后把PCR片段Nanog通過T/A克隆連入pMD19T-Simple，經測序驗證正確。用EcoR I和XhoI對pMD19T-Nanog進行雙酶切然后膠回收目的片段，用T4DNA連接酶將目的片段連接至經相同雙酶切后的pET32a載體中，得到重組質粒pET32a-Nanog。向準備好的大腸桿菌DE3感受態中加入適量的質粒pET32a-Nanog，經熱擊處理后輕輕混勻，于37 ℃、200 r/min搖床培養2.5 h。離心收集菌體，棄掉部分上清液后留100 μL重懸菌體，涂布于含有氨芐霉素的LB培養基平板，37 ℃培養10 h，挑取轉化子進行菌落PCR驗證，將驗證正確的轉化子經搖瓶培養后保存并提取質粒送到上海生工測序，得到大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a-Nanog重組菌株。

1.2.2 重組Nanog蛋白的粗發酵液制備

將重組大腸桿菌BL21(DE3)/ pET32a-Nanog接種于斜面培養基，12 h后從斜面培養基中挑取單菌落接種于裝液量為50 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，在37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，以此作為種子液。將培養好的種子液按體積分數2%接種量轉接至250 mL的三角瓶中，LB液體培養基裝液量為50 mL，于37 ℃、200 r/min培養至OD600為0.6左右后，加入終濃度為0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)。置于37 ℃、200 r/min搖床誘導培養5 h。將發酵液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min收集菌體，棄上清液，用Tris-HCl緩沖液(25 mmol/L Tris，pH 7.4)清洗并重懸菌體。采用超聲波破碎法破碎細胞，冷凍離心后所得上清液即為粗蛋白液。

1.2.3 重組Nanog蛋白的純化

將經超聲破碎及冷凍離心后粗蛋白液用5 mL鎳離子柱對其進行純化。先用40 mL A液(25 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑，pH 7.4)平衡鎳離子柱然后進樣，進樣時流速為1 mL/min。完成進樣后，先用50 mL A液進行柱沖洗，再用體積分數85% A液和體積分數15% B液(25 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑，pH 7.4)洗脫雜蛋白，最后以體積分數100% B液洗脫目的蛋白，收集蛋白峰洗脫液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析。另將得到的上述Nanog洗脫液用含有500 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)進行透析，去除高濃度咪唑，便于后期腸激酶酶切處理。

1.2.4 融合蛋白的酶切

將1 U腸激酶加入到1 mL經純化透析過的含有500 μg的Nanog融合蛋白中，放入含有25 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl和2 mmol/L CaCl2的緩沖液(pH 7.6)中，在25 ℃條件下進行酶切，24 h后取樣，15% SDS-PAGE檢測酶切程度。

1.2.5 重組蛋白的SDS-PAGE及Western blot檢測

取2 mL發酵液于4 ℃冷凍條件下12 000 r/min離心5 min收集菌體，棄上清液，用Tris-HCl緩沖液(25 mmol/L Tris，pH 7.4)清洗并重懸菌體，采用超聲波破碎法破碎細胞，4 ℃冷凍條件下12 000 r/min離心10 min后所得上清液即為蛋白樣品。將蛋白樣品按1.2.4小節的方法處理，然后取40 μL酶切后蛋白樣品加入10 μL 5×蛋白緩沖液，沸水浴變性10 min，12 000 r/min下離心15 min，取其中20 μL進行SDS-PAGE分析。將 SDS-PAGE電泳后的蛋白再電轉至硝酸纖維素膜, 進行Western blot免疫雜交檢測。一抗用兔抗Nanog多克隆抗體(anti-Nanog rabbit polyclonal antibody)，二抗用羊抗兔，根據蛋白大小選擇相應的程序，用干轉儀將蛋白條帶轉移至硝酸纖維素膜上。利用iBindTM全自動蛋白印跡處理系統實現相應一抗的孵育、洗膜；二抗的孵育、洗膜，ECL化學發光法顯色。

1.2.6Nanog蛋白表達量的測定

根據考馬斯亮藍染色法測定其總蛋白濃度，采用統一10 μg的總蛋白樣品量進行SDS-PAGE分析，然后用Image Lab軟件對SDS-PAGE電泳圖進行蛋白條帶灰度掃描，分析出每條泳道Nanog蛋白占總蛋白的百分含量，再根據總蛋白的含量從而計算出Nanog蛋白的含量，該含量僅用于不同發酵條件的對比優化。最終將純化后的目的蛋白通過Bradford法測定獲得相對準確的Nanog蛋白得率。

1.2.7Nanog蛋白表達條件的優化

在保持菌種活化時間一樣的情況下，分別改變搖瓶發酵的誘導溫度、誘導劑含量、補料碳源；15 L發酵罐上改變溶氧(dissolved oxygen，DO)、溫度控制方式等條件。

發酵罐參數設置：設置DO與攪拌轉速相關聯，DO分別設置為(10±3)%、(20±3)%、(30±3)%、(40±3)%，通氣量2 vvm，轉速范圍設置為200～850 r/min，pH設置維持在(7.0±0.2)，溫度設置為(37±0.5) ℃。

發酵溫度控制分別采用全程37 ℃不變；誘導前37 ℃，誘導后30 ℃；誘導前37 ℃，誘導期間30 ℃維持30 min，之后調回37 ℃ 3種方式。具體操作如下：

第一階段溫度設定為37 ℃，重組菌在含有質量濃度20 g/L葡萄糖的培養基中擴增，通過葡萄糖定糖儀測定罐內葡萄糖殘余量，待其耗盡后，通過流動加入甘油的方式補充碳源。第二階段在甘油補加3 h后將溫度分別設定為37 ℃、30 ℃、30 ℃各維持0.5 h，在變溫后添加IPTG對重組大腸桿菌產Nanog蛋白進行誘導表達，其中第3種方式在30 min后將溫度重設為37 ℃，體積分數35%的甘油流加質量濃度為50 g/L。

酶標儀測定波長600 nm處的OD值，并測定最高OD600處的菌體干質量，按照1.2.2小節的方法處理發酵液后制備SDS-PAGE蛋白膠，用Image Lab軟件對SDS-PAGE電泳圖進行蛋白條帶灰度掃描，測定Nanog蛋白表達量，從而對比出最佳發酵條件。

2 結果與分析

2.1 Nanog蛋白表達質粒的構建及驗證

按照1.2.1小節的方法構建重組表達質粒pET32a-Nanog，菌落PCR驗證重組質粒pET32a-Nanog，結果如圖1-a所示，PCR產物在935 bp左右有明顯條帶，這與Nanog基因大小相一致，測序結果與GenBanK報告的基因完全一致，表明獲得了正確的Nanog基因序列。重組質粒用EcoR I和XhoI雙酶切鑒定，結果如圖1-b所示，得到大小分別為5900和935 bp的條帶，分別代表pET32a質粒載體和Nanog基因序列。

a-1,2-重組表達質粒pET32a-Nanog菌落PCR產物； M-DNA Marker; b-1,2-重組表達質粒pET32a-Nanog經EcoR I與Xho I酶切；M-DNA Marker圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測人源Nanog重組載體pET32a-Nanog 和酶切重組表達質粒pET32a-NanogFig.1 Human Nanog recombinant vector pET32a-Nanog and detection of pEF-32a-Nanog by agarose gel electrophoresis

2.2 重組Nanog蛋白在大腸桿菌BL21中的表達與純化

采用超聲破碎法破碎重組大腸桿菌細胞，冷凍離心后將所得上清液進行SDS-PAGE分析，結果如圖2所示，所得重組蛋白在60 kDa左右出現明顯條帶，而將沒有Nanog基因的pET32a空載轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中的發酵上清液中，無法檢測到相應大小的蛋白條帶，沒有經IPTG誘導的重組菌株經培養后也無法檢測到相應的蛋白條帶。重組載體中融合的硫氧還蛋白標簽分子質量大約22 kDa左右,Nanog分子質量約為38 kDa,所以融合Nanog蛋白的分子質量約為60 kDa左右。重組菌所產Nanog蛋白經鎳離子柱親和層析純化后的蛋白在SDS-PAGE中顯示出單一條帶，分子質量約為60 kDa，與之前推測的重組Nanog融合蛋白大小相符。

1-純化后的重組Nanog融合蛋白; 2-IPTG誘導后的重組BL21(DE3)/pE32a-Nanog超聲破碎后上清液; 3-未誘導的重組BL21(DE3)/pET32a-Nanog超聲波破碎后上清液; 4-IPTG誘導后的BL21(DE3)/pET32a空載超聲破碎后上清液; M-蛋白Marker圖2 SDS-PAGE電泳分析pET32a-Nanog重組菌的蛋白表達Fig.2 SDS-PAGE analysis pET32a-Nanog recombinant protein expression

2.3 融合蛋白的酶切

純化后的Nanog 融合蛋白經腸激酶處理后，結果如圖3所示，得到大小分別為38 k與22 kDa左右的蛋白，22 kDa為pET32a上的Trx-His(硫氧還蛋白與組氨酸)標簽蛋白，38 kDa為重組Nanog蛋白，與預期的Nanog蛋白大小相一致。

M-蛋白Marker; 1-腸激酶酶切產物圖3 融合蛋白的腸激酶切割Fig.3 Fusion protein cleaved by enterokinase

2.4 Nanog的Western blot檢測結果

將 SDS-PAGE電泳后的蛋白電轉至硝酸纖維素膜, 進行Western blot免疫雜交檢測。結果如圖4所示，經純化酶切后的Nanog蛋白與市售Nanog多克隆抗體呈陽性反應，而未經IPTG誘導的重組菌裂解液無特異性蛋白條帶，表明制備的Nanog蛋白與Nanog多克隆抗體具有良好的結合特異性。

1-未被IPTG誘導的含重組質粒BL21(DE3)的裂解液; 2,3-經純化酶切后的IPTG誘導含重組質粒BL21(DE3)的裂解液圖4 Western Blotting鑒定Nanog蛋白Fig.4 Western Blotting identify Nanog protein

2.5 發酵條件的優化

2.5.1 誘導溫度

將重組菌BL21/pET32a-Nanog進行搖瓶發酵實驗，于LB培養基中培養過夜后轉接，37 ℃、200 r/min培養2 h后加入0.1 mmol/L的IPTG，保持其他條件一致，分別在25、28、32、37、40 ℃下繼續培養12 h，發酵結束后測定菌體量和蛋白濃度，結果如圖5所示。隨著溫度的升高，蛋白表達量逐漸增多，37 ℃時Nanog蛋白表達量達到最高，因此選擇37 ℃為最佳誘導溫度。

a-菌體生長量和Nanog蛋白表達量; b-Nanog蛋白電泳圖 M-蛋白Marker; 1-40 ℃; 2-37 ℃; 3-32 ℃; 4-28 ℃; 5-25 ℃圖5 不同溫度對菌體量和蛋白表達量的影響Fig.5 The effects of different temperatures on the amount of bacteria and protein expression

2.5.2 誘導劑添加量

重組菌BL21/pET32a-Nanog經 LB培養基培養過夜后轉接37 ℃、200 r/min培養2 h，加入不同濃度的IPTG，保持其他條件一致，在不同誘導劑濃度下繼續培養12 h，發酵結束后測定菌體量和蛋白濃度，發現IPTG濃度為0.2 mmol/L時對菌體表達外源蛋白最多(圖6)，因此選用IPTG誘導劑添加量為0.2 mmol/L。

a-菌體生長量和Nanog蛋白表達量; b-Nanog蛋白電泳圖; M-蛋白Marker; 1-0.05 mmol/L; 2-0.1 mmol/L; 3-0.2 mmol/L; 4-0.4 mmol/L; 5-0.6 mmol/L; 6-0.8 mmol/L; 7-1.0 mmol/L; 8-1.2 mmol/L圖6 不同IPTG濃度對菌體量和蛋白表達量的影響Fig.6 The effects of different IPTG concentrations on bacterial volume and protein expression

2.5.3 不同補料碳源發酵對產Nanog蛋白的影響

以LB培養基為基礎發酵培養基，分別添加質量濃度為10 g/L的葡萄糖、乳糖、甘油、可溶性淀粉、麥芽糖，以原始LB培養基作為對照，發酵結束后考察菌體量和Nanog蛋白的可溶性表達量，篩選出最佳碳源。結果如圖7所示,葡萄糖的存在會抑制目的蛋白表達，但是菌體生長最好;麥芽糖和甘油也能夠促進重組菌生長，但麥芽糖的產蛋白效果明顯比甘油差，原因可能是麥芽糖會加快誘導表達速度，使目的蛋白來不及正確折疊，形成包涵體，從而使可溶性Nanog蛋白表達量減少;甘油既有利于重組菌生長又利于產酶，因此綜合考慮，前期擴增階段選擇葡萄糖補料，后期誘導選擇甘油為補料碳源。

2.6 15 L發酵罐發酵策略

2.6.1 不同溶氧水平對發酵的影響

在種子和發酵條件相同的條件下，在37 ℃、7 h后加終濃度0.2 mmol/L IPTG誘導，考察不同溶氧水平對重組大腸桿菌產Nanog蛋白的影響。結果如表1所示，當DO值在10%、20%、30%時，細胞生物量及Nanog蛋白產量不斷增加，30%Nanog蛋白產量達到最大。當DO值在40%時，細胞生物量及Nanog蛋白產量反而減少。綜合Nanog蛋白的產量，DO控制在20%～30%較好，其值分別達到873、886 mg/L。

a-菌體生長量和Nanog蛋白表達量; b-Nanog蛋白電泳圖;1-對照; 2-甘油; 3-可溶性淀粉; 4-麥芽糖; 5-乳糖; 6-葡萄糖;M-蛋白Marker圖7 不同補料碳源對菌體量和蛋白表達量的影響Fig.7 The effects of different feed carbon sources on the amount of bacteria and protein expression

表1 不同溶氧條件下Nanog蛋白的表達水平Table 1 Nanog protein expression level under different dissolved oxygen conditions

2.6.2 不同發酵溫度控制方式對Nanog蛋白產量的影響

發酵溫度控制分別采用全程37 ℃不變；誘導前37 ℃，誘導后30 ℃；以及誘導前37 ℃，誘導期間30 ℃維持30 min，之后調回37 ℃ 3種方式。結果如表2所示，相比于前2種控溫方式，第3種方法的Nanog蛋白產量最高，其發酵溫度控制方式的大腸桿菌發酵過程生長、溶氧及補料曲線如圖8所示。

表2 不同發酵方式生產Nanog蛋白的性能比較Table 2 Performance comparison of different fermentation methods for producing Nanog protein

圖8 大腸桿菌發酵過程生長及補料曲線Fig.8 Growth and feeding curve of E.coli fermentation

3 討論

大腸桿菌表達系統具有成本低廉、適宜大規模發酵、條件易于自動化控制等優點，通過大腸桿菌表達重組蛋白是一種高效、經濟的方式[13-14]。迄今為止，蛋白質結構數據庫中約60%的蛋白質已使用大腸桿菌表達系統生成[15]，對于大腸桿菌發酵生產代謝產物來說，DO值的控制直接關系著細胞的生長和代謝產物的形成[16]。

發酵罐控制溶氧的實際過程中，誘導劑添加階段若維持37 ℃會導致0.5 h后即使通過提高轉速或是增大通氣量也難以維持其溶氧水平，加之后期維持37 ℃會有大量泡沫產生，加入消泡劑對其真實溶氧水平也有一定影響[17]，最后菌體量雖然很高，但后期溶氧<5%，最終Nanog蛋白產量只有886 mg/L。通過提高設定轉速到1 200 r/min雖能將溶氧重新控制在30%，但過高攪拌轉速產生的剪切力也會對菌體生長產生影響[18-19]，最終目的蛋白含量僅有489 mg/L。因此，在誘導前通過短暫地降低溫度，配合加入IPTG，從而降低其生長速率，在誘導之后再將溫度調回37 ℃，與一直保持37 ℃相比便于后期控制溶氧水平，最終實現重組Nanog蛋白的表達量為1 386.4 mg/L。值得注意的是，后期保持37 ℃誘導培養并不會減少可溶性Nanog融合蛋白的表達量，相較于傳統的誘導后維持低溫培養目的蛋白產量更高，還能縮短總發酵時間。對比NanogP8在pET28a中以包涵體形式表達，表明pET32a載體自帶的硫氧還蛋白可以促進Nanog蛋白的可溶性表達，對比豬源與鼠源Nanog發現，加入硫氧還蛋白后對于不同來源的Nanog，具有81%氨基酸相似度的豬源Nanog也不能實現其可溶性表達[20-21]。另外在優化補料碳源的實驗中發現葡萄糖能抑制Nanog的表達，因此在罐上培養時通過前期加入葡萄糖，一方面為重組菌生長提供所需碳源，另一方面也能在發酵前期抑制外源蛋白表達，從而有利于菌體生長。后期補料改用甘油，可以避免添加葡萄糖影響外源蛋白表達[22]。綜上所述，大腸桿菌發酵產Nanog蛋白是需氧型的，需要控制一定的溶氧量才能有表達，但也不是越高越好，究其原因可能是氧含量過高容易產生含氧自由基破壞細胞組分，從而嚴重影響菌體的生長代謝[23-24]。后續研究中改良表達載體，使其能將目的蛋白分泌到細胞外，并對純化條件進行系統優化，以期提高其蛋白純度。

4 結論

本研究構建了1株能高效表達Nanog蛋白的重組大腸桿菌，首次實現了人源Nanog蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，通過搖瓶優化及進一步的罐上發酵條件優化使得Nanog蛋白產量達到1 386.4 mg/L，并且在發酵罐上也有效控制了溶氧的穩定性問題，罐上發酵12 h就可穩定得到大量可溶性Nanog蛋白，對后續的大規模發酵生產具有一定的指導作用，也為進一步制備Nanog多克隆抗體，研究Nanog在腫瘤發生中的作用奠定了基礎。