兩種紅曲菌固態發酵產莫納可林K和桔霉素的比較

李志強，劉穎，林風，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術開發應用工程研究中心，福建 福州，350007)

紅曲是以大米為主要原料，接種紅曲菌(Monascussp.)經固態發酵制成的紫紅色曲米，有1 000多年的歷史[1]。紅曲被廣泛用作食品著色劑、魚肉防腐劑、醋酒發酵劑以及傳統中藥等，是藥食兩用的傳統中藥材，應用范圍廣，開發價值高，具有重要的經濟意義[2-5]。現代研究發現，紅曲中蘊含多種具有生物活性的物質，如莫納可林類、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、黃酮類及食用色素等[5]。自ENDO(遠藤章)1979年發現紅曲菌可以產生具有降血脂功能的莫納可林K(monacolin K，又名洛伐他汀)以來[6]，紅曲產品的開發已經引起國內外的高度關注。然而，1995年BLANC等[7]發現，紫色紅曲菌和紅色紅曲菌可產生桔霉素(citrinin，又叫桔青霉素)，對脊椎動物具有肝腎毒性和致癌性，因此紅曲菌發酵產品(包括紅曲)的安全性引起了人們的擔憂，限制了紅曲菌發酵產品的應用，并已成為我國紅曲產品出口及新產品開發的限制性因素。因為桔霉素對人體的危害極大，許多國家和地區都對紅曲菌發酵產品的桔霉素含量制定了嚴格的限量標準[8]。目前，我國對紅曲紅色素、紅曲黃色素和功能性紅曲米中的桔霉素做了限量規定[紅曲紅色素的限量標準為40 μg/kg(以單位色價計)，紅曲黃色素的限量標準為1 000 μg/kg，功能性紅曲米的限量標準為50 μg/kg][9-11]。因此篩選低產或不產桔霉素的紅曲菌菌株成為紅曲產業研究的熱點[8,12-13]。

盡管紅曲制作的歷史悠久，但我國第一個紅曲相關標準直至1985年才誕生[1]。現階段相關標準對紅曲生產菌種的規定為：紅曲食品類產品用紅曲菌屬(Monascus)的菌種即可，中藥和保健品對生產菌種統一要求用紫色紅曲菌(Monascuspurpureus)[1,14]。隨著紅曲菌分類學的研究和生產實踐的發展，現行的一些紅曲產品標準對紅曲菌種的規定在一定程度上影響了紅曲產業的更好發展。紅色紅曲菌(Monascusruber)和紫色紅曲菌均為工業上廣泛應用的紅曲菌[5,15]，但前者不在紅曲中藥和保健品的生產菌種之列。本研究采用高效液相色譜法，分析比較選取的22株紅曲菌生產的紅曲中莫納可林K和桔霉素含量，以期為紅曲中藥和保健品相關標準的修訂提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 實驗菌株

本實驗選擇11株M.purpureus和11株M.ruber，共22株。其中，福建省微生物研究所紅曲菌種資源庫10株，中國普通微生物菌種保藏管理中心4株，中國工業微生物菌種保藏管理中心6株，美國模式培養物保存庫(ATCC)2株。

1.1.2 實驗試劑

洛伐他汀標準品(純度99.4%)，中國食品藥品檢定研究院；桔霉素標準品(純度98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;甲醇和乙腈(色譜純)，德國Merck公司產品；H3PO4(色譜純)，天津市光復精細化工研究所產品。其他試劑均為分析純。

1.1.3 培養基配制

馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose agar，PDA)培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂15 g，用于PDA斜面的制備。種子培養基(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨15，酵母粉10，MgSO40.5，KH2PO41，NaNO33，用于紅曲菌的種子培養。米飯培養基：市售大米50 g浸泡過夜，瀝干后裝入500 mL三角瓶中，用于紅曲菌的固態發酵[12]。以上培養基均于121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器和設備

Agilent 1260高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器),美國Agilent公司；Waters 2695高效液相色譜儀(配2475熒光檢測器),美國Waters公司；XA105型電子分析天平(雙量程，d=0.01 mg/0.1 mg),梅特勒-托利多公司；GR110DR型全自動高壓蒸汽滅菌鍋,廈門致微儀器有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統,Millipore公司；S1000 PCR儀,美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲菌株的ITS復核

對選取的菌株采用ITS測序和比對的方法進行菌種復核。菌株的培養參照文獻[15]，培養完成后收集菌絲體用滅菌蒸餾水清洗，加入液氮研磨成粉末，采用生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

ITS的擴增采用引物ITS5 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS4 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)[16]。PCR反應總體積為50 μL： 10×PCR反應緩沖液5 μL，dNTPs(4種濃度均為2.5 mmol/L)1 μL，引物(均為10 μmol/L)各1 μL，Taq聚合酶2 U，DNA模板2 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環；72 ℃終末延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，陽性樣本送測序公司用凝膠回收試劑盒回收目的片段進行雙向測序。

甲洛洛很清楚這個撒尿的女人，她叫澤仁姆，是五個孩子的母親，至于孩子的父親是誰，大家都不知道，或許她自己清楚吧。村里也有傳言，說她的第四個女兒那黑森森的眼睛跟嘎絨的眼睛是一個模子里出來的，可嘎絨總會笑著說：所有眼睛長得黑森森的都是我的孩子，那我可以在村里組建一個隊伍了。

拼接測序得到的ITS序列，并根據測序圖譜人工校正堿基。采用MEGA 6.0軟件[17]對DNA序列進行排序，并對排序結果進行校正，去除5’和3’端非對位排列區。利用MEGA 6.0軟件基于K2P (Kimura 2-parameter)模型的鄰接法(neighbour-joining，NJ)構建系統發育樹，自展1 000次估計各分支的支持率。結合形態特征和多基因的系統發育分析，BARBOSA等[18]修訂了紅曲菌的分類系統，本研究主要參考該分類系統。所下載的各種紅曲菌ITS 序列的GenBank登錄號為：KY635847、KY635848、KY635850、KY635851、AY498585、AY498586、JF922046、KY511726、KY511740和KY511751。構建系統發育樹所用的外類群為黃曲霉(Aspergillusflavus) DQ683124、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)EF661568和煙曲霉(Aspergillusfumigatus)HQ026746。

1.3.2 紅曲的制備

將紅曲菌株接種至PDA斜面培養基活化后參照文獻[12]制備種子液并進行固態發酵。每個菌株做3個平行的固態發酵，未接種紅曲菌的米飯培養基作為空白對照。將固態發酵后經過60 ℃干燥10 h的紅曲米粉碎(60目，粉狀)并充分混合均勻。

1.3.3 莫納可林K含量的測定

按QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)》檢測紅曲中的莫納可林K含量[11]。使用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為25 ℃，檢測波長為238 nm，進樣量為10 μL，流速為1 mL/min。根據保留時間定性化合物，使用外標法根據峰面積定量。自然發酵生產的紅曲中莫納可林K存在酸式和內酯式2種構型，這2種構型含量之和為紅曲中莫納可林K總量。

用體積分數75%乙醇稀釋1 000 μg/mL的洛伐他汀儲備液至質量濃度分別為1、10、30、75、150和400 μg/mL的洛伐他汀標準溶液，按標準進行高效液相色譜分析。以峰面積為縱坐標、洛伐他汀的質量濃度為橫坐標，進行線性回歸分析。R2>0.999時進行樣品測定。

1.3.4 桔霉素含量的測定

參照GB 5009.222—2016《食品安全國家標準 食品中桔青霉素的測定》中的免疫親和柱凈化-高效液相色譜法來檢測紅曲米中的桔霉素含量[19]。使用Waters公司的2695高效液相色譜儀及2475熒光檢測器，激發波長330 nm，發射波長500 nm，色譜柱為C18柱 (4.6 mm× 150 mm, 3.5 μm)，柱溫30 ℃，進樣量為30 μL，流速為0.7 mL/min，流動相條件參照該標準。

用體積分數70%甲醇稀釋桔霉素儲備液至質量濃度分別為0.2、0.5、2、5、10和50 μg/L的桔霉素標準溶液，按標準進樣分析，以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。R2>0.999時測定樣品。

2 結果與分析

2.1 紅曲菌株的ITS復核

現階段主流觀點認為紅曲菌屬共包含10個物種，因此本研究下載了10種紅曲菌模式菌株的ITS序列。利用選取的22株紅曲菌株ITS序列和下載的紅曲菌及外類群ITS序列構建的系統發育樹見圖1。

圖1 利用ITS序列基于Kimura雙參數模型構建的系統發育樹Fig.1 The phylogenetic tree resulted from analysis of the ITS sequences using the Kimura two-parameter model

11株紅曲菌(R3、R5～R14)和M.purpureus的ITS序列完全相同，在系統發育樹中構成一個單系，支持率為66%；10株紅曲菌(R1、R2、R4、R15～R17、R19～R22)和M.ruber的ITS序列之間沒有變異，在系統發育樹中構成一個單系，支持率為86%；菌株R18和M.sanguineus的ITS序列完全相同，這兩者構成的單系支持率為99%。由于不同紅曲菌的ITS序列差異明顯，參考BARBOSA等[18]紅曲菌的分類系統，11株紅曲菌(R3、R5～R14)被鑒定為M.purpureus， 10株紅曲菌(R1、R2、R4、R15～R17、R19～R22)被鑒定為M.ruber，R18被鑒定為M.sanguineus。由于本研究的目的是比較紅色紅曲菌和紫色紅曲菌不同菌株產莫納可林K和桔霉素的能力，因此血紅紅曲菌的數據未納入后續分析。

2.2 紅曲中莫納可林K和桔霉素含量的測定

莫納可林K檢測的回歸方程為y=35.71x-26.47(R2=0.999 9)，莫納可林K在1～400 μg/mL呈良好的線性關系。桔霉素檢測的回歸方程為y=83 477.83x-5 510.89(R2=0.999 7)，桔霉素在0.2～50 μg/L呈良好的線性關系，其檢出限為8 μg/kg。

用21株紅曲菌通過固態發酵生產的紅曲中莫納可林K和桔霉素含量的測定結果見表1。11株紫色紅曲菌發酵生產的紅曲只有R5檢測到莫納可林K，其含量極低；11份紅曲中均檢測出桔霉素，只有R8的桔霉素含量(18.37 μg/kg)未超過50 μg/kg，R14的含量為377.90 μg/kg，其他9份紅曲中的桔霉素含量均>1 000 μg/kg。在10株紅色紅曲菌生產的紅曲中只有R22未檢測到莫納可林K，其他9株紅色紅曲菌所制紅曲中莫納可林K的含量范圍為2.67～14.20 mg/g，酸式莫納可林K的比例為49.79%～87.09%；在4份紅曲(R4、R15、R16和R17)中檢測出桔霉素，但含量均<150 μg/kg。5株紅色紅曲菌(R1、R2、R19、R20和R21)所制作的紅曲中莫納可林K和桔霉素含量均符合QB/T 2447—2007《功能性紅曲米(粉)》中莫納可林K(≥4 mg/g)和桔霉素(≤50 μg/kg)的限量標準。

表1 二十一株紅曲菌所制作的紅曲中莫納可林K和桔霉素的含量Table 1 Monacolin K and citrinin contents of 21 samples of red yeast rice

3 結論與討論

準確的物種鑒定和分類是開展紅曲菌其他相關生物學科學研究的基本條件。分類學研究屬于基礎研究，由于紅曲菌被用于生產具有重大經濟價值和醫藥價值的紅曲，因此，紅曲菌的分類學研究在基礎研究和應用研究中均具有重要意義。長久以來研究者主要依靠形態學和生理生化特征鑒別紅曲菌，導致其菌種名稱較混亂，因此，曾描述記載的種名有30多個[18,20-22]。這些種名主要依靠形態特征，如菌落的形態、顏色和生長速度，以及菌絲、分生孢子、閉囊殼和子囊孢子的形態等命名[20]。傳統的形態學鑒定是開展物種鑒定和系統分類工作的重要手段，但受環境因素影響大[18,23]，存在主觀性強、穩定性和重復性差等局限。因此利用形態特征來命名的物種需進一步采用DNA序列驗證。采用傳統分類方法結合多個基因序列數據的分析，大多數以形態特征命名的紅曲菌被視為同種異名[18,23-24]。DNA序列數據的應用對厘清紅曲菌的分類發揮了積極的作用，為探明傳統紅曲生產中的菌種問題提供了科學依據和先進手段。所以，應該運用分類學的新技術、新成果來分析紅曲生產中的菌種類型、優勢種類，指導實際生產中菌種的選擇和改良以提升紅曲品質等技術問題，促進紅曲產業的健康發展[1]。經過研究，工業上廣泛應用的紅曲菌主要為紅色紅曲菌、叢毛紅曲菌(M.pilosus)和紫色紅曲菌[5,15]。但我國在制定紅曲中藥和保健品的標準時，選定紫色紅曲菌為唯一生產菌種，其理由和依據不明，且難以查證[1,14]。或許是因為當時可依據的文獻數據主要是關于紫色紅曲菌的，但彼時對紫色紅曲菌的研究大部分局限在色曲和釀造曲的生產菌種選育和發酵制作工藝等領域[1]，以此作為選擇高產莫納可林K的功能性紅曲生產菌種的依據不盡合理。

我國工業化生產的紅曲產品主要有3類，即釀造用紅曲、色素紅曲和功能紅曲。紫色紅曲菌在歷史上主要用于生產色素紅曲，原因是這種紅曲菌色素生產能力強，但該菌也是易產桔霉素的紅曲菌種之一[1,14]。本研究證實了這一點：11份由紫色紅曲菌生產的紅曲中均檢測出桔霉素，其中9份紅曲的桔霉素含量均>1 000 μg/kg；相比之下，在10株紅色紅曲菌發酵生產的紅曲中有6株未檢測到桔霉素(檢出限8 μg/kg)，另外4株產桔霉素的能力也較弱。表明紫色紅曲菌生產的色曲，桔霉素超標的幾率較大。已知桔霉素聚酮合酶基因pksCT和轉錄激活因子ctnA在桔霉素的生物合成中起作用：pksCT的缺失導致M.purpureusIFO 30873喪失產桔霉素的能力，ctnA缺失則導致M.purpureus桔霉素的產量降低至幾乎檢測不到的水平[25-26]。在CHEN等[27]的研究中，選用的4株紫色紅曲菌均具有pksCT和ctnA基因，都可產生桔霉素；而6株紅色紅曲菌均缺失pksCT和ctnA基因，發酵產物的桔霉素檢測也呈陰性。紅曲中藥及保健品的生產菌種除了考慮其安全性(桔霉素含量)外，莫納可林K的含量應是衡量紅曲產品質量的關鍵指標之一，因為莫納可林K是該類型紅曲中唯一被闡明具有降膽固醇活性的成分。且最早發現產莫納可林K的紅曲菌為1株分離自泰國食物的M.ruberNo.1005[6]。本研究結果表明，紫色紅曲菌產莫納可林K能力不如紅色紅曲菌，因此,只將紫色紅曲菌列入可用于紅曲中藥和保健食品的真菌菌種名單值得商榷[1,14]。考慮到民間制作紅曲所用的混合菌種應該包含了紅色紅曲菌，紅色紅曲菌也是工業中廣泛應用的紅曲菌之一[5]，且紅色紅曲菌產莫納可林K的能力較強，低產或不產桔霉素的幾率高，紅色紅曲菌應該通過相應程序在紅曲中藥和保健品相關標準中獲得合法地位。本研究以期為將來紅曲中藥和保健品相關標準的修訂提供部分科學依據。