miR-499 與miR-1 對心肌細胞增殖與凋亡調控作用及機制研究

李倩曉 于勤 那榮妹 劉百亭

1.浙江省中西醫結合醫院，浙江 杭州310000；2.大連大學附屬中山醫院，遼寧 大連116001

心肌細胞凋亡是心律失常、心肌梗死、心力衰竭等多種心臟疾病發生、發展過程中的重要病理環節之一［1]。對心肌細胞凋亡進行積極干預已成為治療心臟疾病的關鍵研究方向。微小RNA（microRNA，miRNA）在細胞增殖、分化及凋亡中發揮重要作用，參與心血管疾病、神經系統疾病、腫瘤等病理生理過程［2]。研究顯示，miRNA 可調控30%以上人類基因表達［3]。miR-499、miR-1 是與心臟疾病關系密切的兩種miRNA，近年來已得到廣泛研究，尤其在調控心肌細胞增殖與凋亡方面越來越受到關注，但其具體調控機制目前尚不明確。因此，本研究將miR-499mimics 及miR-1inhibitor轉染至H2O2處理的心肌細胞，探索心肌細胞增殖與凋亡過程中，miR-499 與miR-1 所發揮的調控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 大鼠H9C2 心肌細胞株（中科院上海細胞庫）。

1.2 實驗試劑與儀器 0.05%胰酶/EDTA、胎牛血清、DMEM 培養基（Hycloneo 公司，美國）；競爭性短核糖核苷酸陰性對照序列（scramble-NC）、miR-1 inhibitor、miR-1、miR-499、U6 引物序列（上海吉凱基因化學技術有限公司，中國）；miR-499 mimics（廣州銳博公司，中國）；轉染試劑脂質體Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國）；H2O2、膜聯蛋白（An-nexin）V-異硫/碘化丙錠（PI）細胞凋亡試劑盒、CCK8 試劑盒（碧云天試劑公司，中國）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（Thermo 公司，美國）；β-actin、Bcl-xl、Bax 單抗購自（Epitmics 公司，美國）；ECL 化學發光試劑盒（millipore 公司，美國）；RNasee Free ddH2O、miRNeasy Serum/plasma Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、逆轉錄試劑盒（QIAGEN 公司，德國）；7500 Fast real time PCR 儀（ABI 公司，美國）；酶標儀（Bio Tek 公司，美國）。

1.3 細胞培養 將H9C2 心肌細胞置于培養箱中培養，每3d 進行1 次細胞傳代。實驗前24h 取對數生長期的細胞備用。

1.4 轉染 將細胞分為陰性對照組、miR-499 mimics組、miR-1 inhibitor 組、空白對照組。……