丹皮酚通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷途徑促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡

牛琴， 鈕紅麗， 翟俊英， 王韻一， 馬志賓， 王莉

（河南大學(xué)附屬南陽市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河南南陽 473000）

卵巢癌是一種具有復(fù)雜分子和遺傳變化的異質(zhì)性疾病[1]，是最常見的婦科惡性腫瘤之一[2]。卵巢癌在腹腔內(nèi)浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，形成低氧、低糖的獨特微環(huán)境，早期癥狀不明顯，常被診斷為晚期廣泛轉(zhuǎn)移[3-4]。開發(fā)新的藥物對卵巢癌的治療至關(guān)重要。天然產(chǎn)物一直是新型抗腫瘤藥物的潛在來源。牡丹皮，為芍藥科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.的根皮，味苦、辛，性微寒，歸心、肝、腎經(jīng)，具有清熱涼血、活血化瘀的功效。丹皮酚是從牡丹皮中分離出來的具有生物活性的黃酮類化合物[5]，具有抗炎、抗氧化、抗凝、增加細(xì)胞免疫力[6]和抗腫瘤活性[7-10]的作用。既往有研究表明，丹皮酚呈劑量-時間依賴性抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的增殖，且對正常卵巢上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性較小[11]，提示丹皮酚可能是一種有前途的卵巢癌治療藥物。因此，本研究探討丹皮酚通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷途徑對卵巢癌細(xì)胞凋亡的作用及其分子機制，以期進(jìn)一步為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1. 1細(xì)胞人正常卵巢表面上皮細(xì)胞HOSEpiC（WD100539）和人類卵巢癌細(xì)胞SKOV3（WG101715），來源于美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。按照ATCC提供的說明書進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2藥物與試劑丹皮酚（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20266-20mg）。細(xì)胞計數(shù)試劑盒8（CCK8）（上海江萊生物科技有限公司，48T/96T）；RPMI 1640（美國Gibco 公司）；Annexin V-FITC（德國Miltenyi 公司）；碘化丙錠（propidium iodide，PI）（美國Axygen 公司）；溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）及其抗體（美國Abcam 公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Ki67、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、Bcl-2、Bax、葡萄糖調(diào)控蛋白78（GRP78）、CCAAT 增強子結(jié)合蛋白（C/EBP）同源（CHOP）、cleaved Caspase-12、cleaved Caspase-3、細(xì)胞色素c（Cyto-c）、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、細(xì)胞色素c 氧化酶4（COX IV）、cleaved Caspase-9等抗體（美國NEB公司）；線粒體提取試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；線粒體蛋白提取試劑盒（南京恩晶生物技術(shù)有限公司）。

1. 3儀器BX43 生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；21261000酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；1026流式細(xì)胞儀（常州必達(dá)科生物科技有限公司）；Classic酶聯(lián)免疫斑點圖像分析儀（德國AID 公司）；Ti2 系列倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與分組將HOSEpiC細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70% ～80%時即可進(jìn)行后續(xù)實驗。將HOSEpiC 細(xì)胞隨機分為 9 個不同劑量（0、1、2、3、4、5、6、7、8 mmol/L）丹皮酚組。將SKOV3細(xì)胞以含體積分?jǐn)?shù)10%FBS 的RPMI 1640 中培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱孵育，當(dāng)SKOV3 細(xì)胞達(dá)到亞融合時，將SKOV3 細(xì)胞隨機分為6 個不同劑量（0、1、2、3、4、5 mmol/L）丹皮酚組。待檢。

1. 5 CCK8法測定細(xì)胞存活率為了檢測丹皮酚對HOSEpiC 和SKOV3 細(xì)胞的毒副作用。將不同劑量丹皮酚處理過的HOSEpiC 和SKOV3 細(xì)胞，分別接種于96 孔板（1×105/孔），每組至少設(shè)置6 個重復(fù)孔。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，每孔加入10 μL CCK8 溶液（0.5 mg/mL），培養(yǎng)4 h。結(jié)束培養(yǎng)后，在酶標(biāo)儀上測定波長450 nm 處各孔細(xì)胞的吸光度（optical density，OD）值，利用公式計算細(xì)胞成活率：細(xì)胞存活率= [（ODs-ODb）/（ODc-ODb）] ×100%。其中，ODs 為實驗孔吸光度，ODb 為空白孔吸光度，ODc為對照孔吸光度。

1. 6 BrdU染色法測定細(xì)胞增殖能力按照BrdU說明書，收集1、2、5 mmol/L丹皮酚處理的SKOV3細(xì)胞，終止培養(yǎng)前加入10% BrdU，40 g/L 多聚甲醛固定20 min，0.2%Triton X-100 滲透10 min，于4 ℃與BrdU 抗體共培養(yǎng)過夜。最后用DAPI 進(jìn)行染色，并用熒光顯微鏡（×200）拍照。

1.7蛋白免疫分析（Western Blot）法檢測SKOV3細(xì)胞中Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、GRP78、CHOP、cleaved Caspase-12、cleaved-Caspase-3、Cyto-c、AIF、cleaved Caspase-9表達(dá)水平收集 1、2、5 mmol/L 丹皮酚處理24 h 后的SKOV3 細(xì)胞，使用線粒體提取試劑盒分離線粒體和胞漿蛋白。再用線粒體蛋白提取試劑盒提取線粒體蛋白，用Bradford方法測定蛋白質(zhì)含量。用由12%聚丙烯酰胺溶解凝膠和8%堆積凝膠組成的不連續(xù)系統(tǒng)電泳分級分離蛋白質(zhì)樣品（100 g），然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。以100 V和250 mA（電流常數(shù)）通電70 min。洗膜，用50 g/L 脫脂奶粉封膜，加入一抗Ki67（1∶2 000）、PCNA（1∶2 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、 GRP78（1∶3 000）、 CHOP（1∶1 000）、cleaved Caspase-12、cleaved Caspase-3（1∶1 000）、Cyto-c（1∶1 000）、AIF（1∶1 000）、cleaved Caspase-9（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。次日，二抗孵育1 h。通過增強的化學(xué)發(fā)光程序檢測結(jié)合的辣根過氧化物酶綴合的二抗，使用酶聯(lián)免疫斑點圖像分析儀（AID）分析在硝酸纖維素膜上捕獲的信號來確定蛋白質(zhì)表達(dá)水平。實驗中目的蛋白的表達(dá)水平以其相對于GAPDH的表達(dá)來表示。

1. 8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平收集1、2、5 mmol/L丹皮酚處理24 h后的SKOV3細(xì)胞，分別加入200 μL的Annexin V-FITC和PI（10 μg/mL），避光在室溫中孵育15 min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長480 nm，發(fā)射波長525 nm，采集SKOV3 細(xì)胞靜息期熒光強度值，30 s 后加抗CD3mAb 和抗CD28mAb，采集信號，10 min 后終止，以熒光強度代表細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。最后用FACS 軟件分析Ca2+濃度的變化。

1. 9統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1丹皮酚對HOSEpiC和SKOV3細(xì)胞的毒副作用圖1 結(jié)果顯示：高劑量（6 ～8 mmol/L）丹皮酚處理后，HOSEpiC 細(xì)胞存活率劑量依賴性地下降（P＜ 0.05）。低劑量（2 ～ 5 mmol/L）丹皮酚處理后，SKOV3 細(xì)胞存活率劑量依賴性地下降（P＜0.05）。表明丹皮酚2 ～5 mmol/L 對正常細(xì)胞無毒性，且劑量依賴性地抑制SKOV3 細(xì)胞的存活，因此選擇丹皮酚1 ～5 mmol/L進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 丹皮酚對HOSEpiC和SKOV3細(xì)胞的毒副作用Figure 1 The toxic side effects of paeonol on HOSEpiC and SKOV3 cells

2. 2丹皮酚抑制SKOV3細(xì)胞增殖利用BrdU 染色法測定丹皮酚對SKOV3 細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，丹皮酚1、2、5 mmol/L 均降低SKOV3 細(xì)胞增殖能力，其中丹皮酚2、5 mmol/L 的降低效果有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。Western Blot 法進(jìn)一步檢測了增殖相關(guān)標(biāo)記蛋白Ki67、PCNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，丹皮酚1、2、5 mmol/L均降低Ki67、PCNA 蛋白的表達(dá)水平，其中丹皮酚2、5 mmol/L 的降低效果有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。表明丹皮酚可通過抑制Ki67 和PCNA 的表達(dá)劑量依賴性地抑制SKOV3 細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果見圖2。

圖2 丹皮酚抑制SKOV3細(xì)胞增殖（x±s）Figure 2 Paeonol inhibits SKOV3 cell proliferation（x ± s）

2.3丹皮酚促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測定丹皮酚對SKOV3 細(xì)胞調(diào)亡的影響，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，丹皮酚1、2、5 mmol/L均升高SKOV3細(xì)胞凋亡率，其中丹皮酚2、5 mmol/L的升高效果有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。結(jié)果見圖3。

2. 4丹皮酚調(diào)控SKOV3細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)本研究進(jìn)一步觀察丹皮酚促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡潛在的分子機制。Western Blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡通路蛋白GRP78、CHOP、 cleaved Caspase-12、 cleaved Caspase-3表達(dá)的結(jié)果顯示：與空白對照組比較，丹皮酚1、2、5 mmol/L 均升高 GRP78、CHOP、cleaved Caspase-12、cleaved Caspase-3 的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），其中丹皮酚2、5 mmol/L的升高效果有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，丹皮酚1、2、5 mmol/L 均升高Ca2+含量（P＜0.05），其中丹皮酚2、5 mmol/L的升高效果有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。具體結(jié)果見圖4。表明丹皮酚可通過促進(jìn)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)中激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡通路，促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡。

圖3 丹皮酚促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡（x±s）Figure 3 Paeonol promoted SKOV3 cell apoptosis（x ± s）

圖4 丹皮酚調(diào)控SKOV3細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)（x±s）Figure 4 Paeonol regulated and controlled the endoplasmic reticulum stress apoptosis pathway-associated proteins in SKOV3 cells（x ± s）

2. 5丹皮酚調(diào)控SKOV3細(xì)胞中線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)本研究觀察丹皮酚對SKOV3 細(xì)胞中線粒體損傷相關(guān)的細(xì)胞調(diào)亡途徑的影響，Western Blot 檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，丹皮酚1、2、5 mmol/L 均降低線粒體Cyto-c、AIF，升高胞質(zhì)Cyto-c、AIF 的表達(dá)水平，升高cleaved Caspase-9表達(dá)水平，下調(diào)Bcl-2及上調(diào)Bax表達(dá)水平，其中丹皮酚2、5 mmol/L 的降低或升高效果有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且呈劑量依賴性。具體結(jié)果見圖5。表明丹皮酚可通過激活SKOV3 細(xì)胞中線粒體損傷相關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖5 丹皮酚調(diào)控SKOV3細(xì)胞中線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)（x±s）Figure 5 Paeonol regulated and controlled the mitochondria apoptosis pathway-associated proteins in SKOV3 cells（x ± s）

3 討論

本研究首先應(yīng)用CCK8法檢測丹皮酚對人正常卵巢表面上皮細(xì)胞HOSEpiC 和人類卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的毒副作用，結(jié)果篩選出對正常卵巢細(xì)胞無毒的濃度范圍，選擇1 ～5 mmol/L的丹皮酚進(jìn)行后續(xù)實驗。此與研究結(jié)果[11]一致。本研究結(jié)果亦顯示，丹皮酚可劑量依賴性地降低SKOV3 細(xì)胞的存活率，下調(diào)增殖相關(guān)標(biāo)記蛋白Ki67 和PCNA 的蛋白表達(dá)，表明丹皮酚可抑制SKOV3細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動死亡過程，又稱程序性細(xì)胞死亡，對多細(xì)胞生物體發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、腫瘤監(jiān)視、免疫系統(tǒng)功能等的維持有重要的意義。細(xì)胞凋亡可以被多種生理性、病理性刺激誘發(fā)，其過程在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為胞質(zhì)濃縮、核染色質(zhì)凝縮、DNA 大規(guī)模斷片化、細(xì)胞膜內(nèi)陷并發(fā)泡形成凋亡小體。目前研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡除了存在細(xì)胞核的變化外，細(xì)胞質(zhì)中的變化（主要表現(xiàn)為細(xì)胞器改變）也是細(xì)胞凋亡病理改變的重要組成部分，其中線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起著重要的調(diào)節(jié)作用[12]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種動態(tài)的細(xì)胞器，通過控制脂質(zhì)代謝、Ca2+儲存和蛋白穩(wěn)定，參與多種細(xì)胞功能。研究證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞自噬和凋亡[13]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的主要儲存庫。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞可引起細(xì)胞凋亡[14]。GRP78能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15]。CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的未折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的凋亡通路的下游元件之一[16]。Caspase-12作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號標(biāo)記物，參加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡[17]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)凋亡效應(yīng)分子Caspase-3 表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，丹皮酚劑量依賴性地促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白 GRP78、CHOP、cleaved Caspase-12 和cleaved Caspase-3 的蛋白表達(dá)，以及促進(jìn)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡。

線粒體形態(tài)與癌癥疾病之間存在重要聯(lián)系，是癌癥進(jìn)展的重要因素[19-20]。卵巢癌細(xì)胞內(nèi)低氧、低血糖的微環(huán)境，使癌細(xì)胞為了在不利的環(huán)境下生存，轉(zhuǎn)向了線粒體呼吸[3]。線粒體的空間分布與卵巢癌的腫瘤轉(zhuǎn)移和耐藥性有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平異常升高時，線粒體Ca2+的攝取會破壞線粒體的電子傳遞活動，觸發(fā)細(xì)胞膜通透性變化，使Cyto-c 和其他線粒體凋亡蛋白釋放到細(xì)胞溶膠中[21]。Cyto-c與心磷脂相互作用參與線粒體介導(dǎo)的凋亡啟動[22]。Cyto-c釋放到胞質(zhì)中，引發(fā)下游凋亡相關(guān)的Capase-9 上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。在凋亡過程中，凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核，引起核內(nèi)DNA凝集并斷裂形成許多片段[24]。線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致Bcl-2 家族促凋亡的Bax 上調(diào)表達(dá)，而抑制凋亡的Bcl-2 下調(diào)表達(dá)[23]。本研究結(jié)果表明，丹皮酚劑量依賴性地調(diào)控線粒體相關(guān)通路Cyto-c、AIF、cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，丹皮酚可劑量依賴性地調(diào)控SKOV3 細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷的凋亡相關(guān)途徑，促進(jìn)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞凋亡。但凋亡可能的通路、Bcl-2 家族及Caspase 等對凋亡的調(diào)節(jié)機制、各通路間的相互關(guān)系復(fù)雜，如有研究[12]表明，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是細(xì)胞凋亡的重要通路，2 條凋亡通路最終都激活Caspase，線粒體的凋亡途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及Ca2+又是密切相關(guān)的。對此，有關(guān)細(xì)胞凋亡的研究及丹皮酚的作用還有待下一步深入探討。