通膽湯對原發(fā)性膽汁性膽管炎模型小鼠Mac-2BP表達(dá)的影響

唐海鴻， 張彩鳳， 周利軍， 姜小艷， 魏春山， 童光東

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518033；2.深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院，廣東深圳）

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種以慢性肝內(nèi)膽汁淤積為特征的自身免疫性疾病[1]。熊去氧膽酸（ursodesoxycholic acid）仍是一線用藥，但只能使60%左右的患者在治療1年后達(dá)到生化應(yīng)答，從而延緩疾病的進(jìn)展[2]，生物化學(xué)應(yīng)答不佳是PBC 患者死亡、肝移植或肝臟并發(fā)癥的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[3-4]。本課題組前期長達(dá)12 年的臨床研究顯示，通膽湯聯(lián)合熊去氧膽酸治療可以明顯延緩早中期PBC患者的疾病進(jìn)展[5]。為進(jìn)一步探討通膽湯的干預(yù)作用及機(jī)制，本研究采用2-辛炔酸結(jié)合牛血清白蛋白（2OA-BSA）對Mac-2 結(jié)合蛋白（Mac-2BP）基因敲除及野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行造模，使其從生化、免疫及病理上出現(xiàn)類似PBC的慢性膽汁淤積表現(xiàn)，再給予通膽湯進(jìn)行干預(yù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動物SPF 級C57BL/6 小鼠，雌雄各半，5 ～ 6 周齡，體質(zhì)量15 ～ 22 g。Mac-2BP 基因敲除C57BL/6 小鼠，基因名稱：Lgals3bp（lectin，galactoside-binding， soluble， 3 binding protein），GenBank ID：19039。4對純合子小鼠（詳見圖1、2鑒定結(jié)果），繁殖到60 只，每代均進(jìn)行純合子檢測。基因敲除和野生型C57BL/6 小鼠均購自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司，動物質(zhì)量合格證號：444102017042108。

1. 2通膽湯及其流浸膏制備通膽湯由瓜蔞皮30 g、絲瓜絡(luò)30 g、橘絡(luò)15 g、青皮15 g、生地黃20 g、熊膽粉0.5 g組成。由我院中藥制劑科制成濃縮膏，其中，熊膽粉是在藥物冷卻后再加入一起攪拌，旋轉(zhuǎn)風(fēng)干多余的水分。按照人與實(shí)驗(yàn)動物之間藥物劑量的換算公式[6]，計(jì)算小鼠的等效劑量為15.0 g·kg-1·d-1，確定生藥含量為2.1 g/mL（實(shí)驗(yàn)中灌胃劑量為0.02 mL/g），于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑與儀器含H37RA結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（美國Sigma Aldrich 公司，10 mL/支，批號：F5506）；百日咳毒素（北京博蕾德公司，50 μg/支）；生化檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis 試劑盒、SuperMixTransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Mac-2BP 抗體（美國Proteintech Group 公司）。全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）；H1850R 臺式冷凍離心機(jī)（湘儀公司 ）； EG11504 脫 水 機(jī) 、 ASP300S 包 埋 機(jī) 、EG1150C 冷卻臺及 RM2235 切片機(jī)（德國 Leica 公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）；ABI 7500 熒光定量PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司）；垂直電泳槽和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；天能5200 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能儀器有限公司）。

1.4 PBC小鼠模型的構(gòu)建2OA-BSA的制備參考Wakabayashi 等[7]的研究。C57BL/6 野生型小鼠30只，基因敲除小鼠25 只，其中5 只野生型小鼠注射等量生理鹽水作為空白對照組，其余小鼠在造模第1天和第3天腹腔注射混合溶液：50 μL 2OABSA 溶液[100 μg 2OA-BSA 溶于 50 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）]、50 μL 含H37RA 結(jié)核分枝桿菌的完全弗氏佐劑（H37RA 濃度為1 mg/mL）和100 μL 百日咳溶液（濃度為1 ng/μL 的百日咳毒素PBS 溶液）。造模第3 周時(shí)統(tǒng)一單次給藥，每只小鼠腹腔注射100 μL混合溶液（100 μg 2OA-BAS 溶于50 μL PBS，并輔以50 μL不完全弗氏佐劑）。造模第8周時(shí)，取對照組5 只小鼠以及2 組造模小鼠各5 只，通過眼眶靜脈叢采集血液標(biāo)本進(jìn)行生化學(xué)檢測，另取肝組織行蘇木素-伊紅（HE）染色。

1.5分組與給藥模型鑒定后，對PBC模型構(gòu)建成功的C57BL/6小鼠進(jìn)行分組。A組：Mac-2BP基因敲除小鼠，共20 只；B 組：野生型C57BL/6 小鼠，共20 只。采用完全隨機(jī)數(shù)字法，A 組隨機(jī)分為A1、A2 組，B 組隨機(jī)分為 B1、B2 組，每組小鼠各10 只。其中：A1、B1 組為對照組，給予等劑量PBS 灌胃；A2、B2 組為干預(yù)組，按體質(zhì)量給予通膽湯流浸膏灌胃。每天1 次，連續(xù)干預(yù)12 周。干預(yù)12 周后全部處死，采集血液標(biāo)本進(jìn)行生化指標(biāo)檢測，取肝組織-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 肝組織HE 染色 處死小鼠分離肝臟組織以40 g/L多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇梯度脫水后，二甲苯處理增加組織透明度，浸蠟、包埋，組織切片（厚度4 μm）貼于載玻片上，進(jìn)行HE染色，二甲苯充分透明后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理結(jié)構(gòu)變化。

1.6.2 生化檢測 采血并應(yīng)用全自動生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（T-BIL）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）和白蛋白（ALB）的含量。操作方法參考試劑盒內(nèi)說明書。

1. 6. 3 定量聚合酶鏈反應(yīng)（q-PCR）檢測肝組織Mac-2BP mRNA表達(dá) 取肝組織，用TRIzol法提取RNA，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，SuperMixTransStart Top Green qPCR SuperMix 試劑盒進(jìn)行PCR 檢測。Mac-2BP 基因上游引物序列：5’-GAACCTTTTGGATGCCCACG-3’；下游引物序列：5’-CGTGGTATCGTTGGAGCAGA-3’。內(nèi)參為GAPDH。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.6.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測肝組織Mac-2BP 蛋白表達(dá) 取凍存肝組織裂解，勻漿，用考馬斯亮藍(lán)染色法對上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，各組取50 μg蛋白進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育，電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，天能5200 全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測分析。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組比較采用單因素方差分析。采用Levene 法檢驗(yàn)方差齊，如果方差齊，采用F檢驗(yàn)進(jìn)行總均值比較。采用SNK 法進(jìn)行兩兩比較，如Levene 法檢驗(yàn)，方差不齊，改用Dunnett T3 或Dunnett T2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。對于2組之間的肝功能指標(biāo)變化采用配對T檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠Mac-2BP基因敲除鑒定Mac-2BP 基因位于C57BL/6 小鼠的11 號染色體，共鑒定出6 個(gè)外顯子，其中外顯子2 中的ATG 為起始密碼子，外顯子6 中的TAA 為終止密碼子（轉(zhuǎn)錄本：ENSMUST00000043722）。選擇外顯子作為靶位點(diǎn)。Cas9和gRNA被共同注射到受精卵中以用于Mac-2BP基因敲除C57BL/6小鼠生產(chǎn)，所得幼崽將通過PCR 進(jìn)行基因分型及測序分析，并確定該基因敲除成功。具體見圖1、2。

WT 野生型C57BL/6 小鼠的PCR 結(jié)果顯示，Mac-2BP基因敲除成功，8只小鼠樣本全部只得到目標(biāo)片段，敲除結(jié)果得到初步驗(yàn)證。再經(jīng)測序確認(rèn)敲除Mac-2BP 基因2-5 外顯子片段。堿基序列比對達(dá)到敲除目標(biāo)，剩余目標(biāo)片段609 bp 堿基。測序PCR 引物，F(xiàn)1：5’-AGTATCCCTCTCTAGTAT GGGTGAC-3’。

2. 2 Mac-2BP基因敲除小鼠逐代繁殖及純合子鑒定采用廣州賽業(yè)生物提供的純合子鑒定方法，分別進(jìn)行2 次PCR 檢測。新生小鼠首先使用F1/R1引物PCR鑒定，獲得609 bp條帶說明為基因敲除陽性小鼠（此時(shí)不能區(qū)分純雜合子），結(jié)果見圖3。然后使用F2/R2 引物對陽性小鼠再次進(jìn)行PCR 鑒定，如果588 bp 處有條帶，說明小鼠是雜合子，沒有588 bp 條帶的為Mac-2BP 基因敲除小鼠純合子，結(jié)果見圖4。共鑒定了320 只Mac-2BP基因敲除小鼠，最后篩出來60 只Mac-2BP 基因敲除小鼠純合子，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。F1：5’-AGTATC CCTCTCTAGTATGGGTGAC-3’；R1：5’-TTCCA AAGTTCCAGTCTCTCTCTGC-3’。目的條帶大小609 bp。F2：5’-AGTATCCCTCTCTAGTATGGGTG AC-3’；R2：5’-AGAAGGGGTGAAAGCTCTGATG AC-3’。目的條帶大小588 bp。

2.3 PBC模型小鼠的造模結(jié)果Mac-2BP 基因敲除小鼠與正常小鼠在形態(tài)上無區(qū)別。5 ～6 周齡時(shí)開始造模，小鼠平均體質(zhì)量為（16.5 ± 0.84）g。隨著造模時(shí)間的延長，2 組小鼠逐漸出現(xiàn)食欲減退、精神萎靡及反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)，體質(zhì)量較造模前出現(xiàn)下降，造模后平均體質(zhì)量為（13.1±0.91）g（P＜0.05，與造模前比較）。造模后的小鼠肝臟均較對照組增大，色澤變黃，見圖5。但正常組與基因敲除組小鼠造模后形態(tài)外觀上無明顯差異。所有造模小鼠肝臟病理顯示淋巴細(xì)胞在匯管區(qū)輕度浸潤，特別是損傷的小葉內(nèi)膽汁導(dǎo)管，在一些匯管區(qū)中觀察到膽管損失和上皮樣肉芽腫，并且在肝實(shí)質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)肉芽腫，在病理上其改變與人PBC的肝臟病理存在較好的一致性。見圖6。

圖1 C57BL/6小鼠Mac-2BP基因敲除PCR鑒定Figure 1 PCR identification of Mac-2BP gene knockout in C57BL/6 mice

圖2 C57BL/6小鼠Mac-2BP基因敲除測序結(jié)果Figure 2 Sequencing results of Mac-2BP gene knockout in C57BL/6 mice

圖3 F1/R1引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 PCR amplification results of F1/R1 primer

圖4 F2/R2引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 4 PCR amplification results of F2/R2 primer

圖5 對照組與PBC模型（A、B組）小鼠肝臟外觀形態(tài)比較Figure 5 Comparison of liver appearance in control group and model mice（group A，B）

2. 4 PBC模型小鼠肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果造模8 周后，A組、B組小鼠的ALT、AST、ALP、TBil、GGT 水平較對照組均顯著升高（P＜ 0.01），ALB 水平較對照組顯著降低（P＜0.01），見表1。表明模型小鼠肝功能指標(biāo)改變主要以ALP 及GGT 升高為主，伴隨有ALT、AST 的升高和ALB 的明顯下降，結(jié)合小鼠肝臟病理觀察，提示在一定程度上符合人類PBC的表現(xiàn)。

圖6 對照組與PBC模型小鼠肝組織病理變化比較（HE染色）Figure 6 Comparison of the pathological changes in liver tissue of the control group and PBC model mice（by HE staining）

2. 5各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP蛋白表達(dá)比較圖7 結(jié)果顯示：A1、A2 組肝組織Mac-2BP蛋白均沒有明顯表達(dá)；與B1 組比較，B2 組Mac-2BP 的蛋白表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。

2.6各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP的mRNA表達(dá)比較圖8 結(jié)果顯示：A1、A2 組肝組織Mac-2BP mRNA 均沒有明顯表達(dá)；與B1 組比較， B2 組Mac-2BP 的mRNA 表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。

2. 7各組PBC小鼠肝功能比較表2 結(jié)果顯示：干預(yù)后，A、B 組組內(nèi) AST、ALT、ALP、Tbil 及GGT 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但A 組組內(nèi)的ALB 水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A1 組肝功能指標(biāo)與B1 組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A2組ALT、ALP、GGT水平較B2組降低，ALB水平較B2組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明通膽湯均可顯著改善Mac-2BP基因敲除小鼠和野生型C57BL/6小鼠的肝功能情況，且對野生型C57BL/6小鼠肝功能的改善作用優(yōu)于對Mac-2BP基因敲除小鼠的改善作用。

3 討論

既往研究多應(yīng)用α-異硫氰酸萘酯（ANIT）誘導(dǎo)構(gòu)建動物原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）模型，但ANIT 所致的膽汁淤積模型更符合急性膽汁淤積的病理 及 生化改變[8]。Wakabayashi 等[7]在 C57BL/6 小鼠中以外源性物質(zhì)2OA-BSA 輔以完全弗氏佐劑腹腔內(nèi)注射免疫誘導(dǎo)并觀察至24 周，結(jié)果顯示模型小鼠出現(xiàn)自身免疫性膽管炎、血清AMA 陽性、肝組織內(nèi)浸潤的淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，后者尤指共表達(dá)CD44的CD8+T細(xì)胞。張慧等[9]研究發(fā)現(xiàn)，按照上述方法誘導(dǎo)8 周，模型小鼠肝組織可見匯管區(qū)周圍和肝內(nèi)小膽管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，認(rèn)為該小鼠PBC造模方法可行性強(qiáng)，形成周期短，穩(wěn)定可靠。本研究亦應(yīng)用2OA-BSA 誘導(dǎo)8 周構(gòu)建C57BL/6小鼠PBC模型，結(jié)果顯示模型小鼠肝臟組織病理及血清生化指標(biāo)變化能較好地模擬人PBC的相關(guān)病理變化，且野生型小鼠與Mac-2BP基因敲除小鼠在生化及肝臟組織病理改變上無明顯差異。

表1 對照組與PBC模型小鼠肝功能指標(biāo)比較Table 1 Comparison of liver function indicators in control group and PBC model mice （x ± s）

圖7 各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP蛋白表達(dá)比較（x±s）Figure 7 Comparison of the protein expression level of Mac-2BP in liver tissue of PBC mice in various groups（x ± s）

圖8 各組PBC小鼠肝組織Mac-2BP的mRNA表達(dá)比較（x ± s）Figure 8 Comparison of the mRNA expression level of Mac-2BP in liver tissue of PBC mice in various groups（x ± s）

本研究是采用CRISPR-AI 敲除C57BL/6 小鼠精子，使其進(jìn)行繁殖，然后產(chǎn)生純合子的Mac-2BP基因缺陷C57BL/6 小鼠，該過程大概需要16 周左右的時(shí)間。再以該鼠繁殖至實(shí)驗(yàn)所需要的數(shù)量，一共繁殖了320只Mac-2BP基因敲除小鼠，最后篩選出60 只純合子Mac-2BP 基因敲除小鼠，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示使用該方法獲得基因敲除小鼠，其純合子小鼠的比例是比較低的，且耗時(shí)較長。但在造模及干預(yù)當(dāng)中，小鼠的死亡率不到10%。

表2 各組PBC小鼠肝功能比較Table 2 Comparison of liver functions in PBC mice of various groups （x ± s）

近年來中西醫(yī)結(jié)合治療PBC 顯示出一定的療效[10-11]。本課題組前期臨床應(yīng)用通膽湯聯(lián)合熊去氧膽酸治療可以明顯延緩早中期PBC 患者的疾病進(jìn)展[5]。通膽湯主要根據(jù)全國名老中醫(yī)朱良春教授治療膽石癥及膽囊炎經(jīng)驗(yàn)而成，方中：瓜蔞皮，味甘、微苦、性寒，能寬胸降氣、消痰開結(jié)，可蕩滌胸中郁熱垢膩，重用為君藥；絲瓜絡(luò)祛風(fēng)通絡(luò)、化痰除濕，其脈絡(luò)與肝內(nèi)膽管及血管走形類似，有取類比象之意，重用為臣；青皮行氣引經(jīng)、疏肝利膽，合為臣藥，腑氣以通為順，行氣通腑藥物有利膽消炎及排泄毒素等作用，有利于膽囊炎及淤膽等病情的緩解；熊膽粉為黑熊的干燥膽汁，能清肝明目，在世界第一本國家藥典《唐本草》中就有關(guān)于干黑熊膽汁治療黃疸的記載。

Mac-2BP 是廣泛表達(dá)的分泌型糖蛋白，一直被視為與疾病診斷、預(yù)后差和對治療反應(yīng)不佳相關(guān)的重要臨床標(biāo)記物[12]。研究表明，Mac-2BP主要在腫瘤疾病中高表達(dá)[13-14]，可能與活化血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤相關(guān)血管生成有關(guān)[15]。Mac-2結(jié)合蛋白與人巨噬細(xì)胞相關(guān)凝集素Mac-2結(jié)合[16]。有學(xué)者提出了血清多花紫藤凝集素陽性巨噬細(xì)胞結(jié)合蛋白[Wisteria floribunda agglutinin- positive Mac- 2 binding protein，WFA（+）-M2BP]水平可以預(yù)測肝纖維化進(jìn)展及肝癌的發(fā)生[17-19]。本研究結(jié)果顯示，通膽湯可改善PBC 模型小鼠的生化學(xué)指標(biāo)，且對野生型小鼠生化學(xué)指標(biāo)的改善作用較基因敲除型小鼠更為明顯，結(jié)合野生型小鼠Mac-2BP 的表達(dá)情況，通膽湯干預(yù)后野生型小鼠的Mac-2BP 表達(dá)量明顯降低，認(rèn)為通膽湯改善PBC 小鼠的膽汁淤積情況，可能與下調(diào)Mac-2BP 的表達(dá)相關(guān)，但其具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。