蠲痹湯加味防治大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

周沛， 賈雪芹， 李梓灝， 黃剛

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120；3.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州 510320）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，伴有骨質(zhì)增生、滑膜炎等的退行性病變，占所有骨性關(guān)節(jié)炎的50%，多發(fā)于老年人和絕經(jīng)后女性[1]。據(jù)調(diào)查，我國KOA患病率為15%，老年人群高達(dá)37%[2-3]。隨著人口老齡化、肥胖等危險(xiǎn)因素的增加，KOA 的發(fā)病率呈現(xiàn)上升的趨勢。KOA 可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形和關(guān)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，積極治療KOA 對(duì)提高患者關(guān)節(jié)功能和改善生活質(zhì)量具有重要的意義。目前，除關(guān)節(jié)鏡下手術(shù)外，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)KOA 主要以抗炎、鎮(zhèn)痛等治療為主，雖然可減輕疼痛，但是無法延緩病情進(jìn)展和修復(fù)關(guān)節(jié)等，效果不甚理想[4]。KOA屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，其病機(jī)主要為腎虛、風(fēng)寒濕痹阻，臨床常應(yīng)用蠲痹湯加減治療KOA[5]。本課題組應(yīng)用蠲痹湯湯加味治療KOA 取得良好的療效，但其具體機(jī)制尚不明確。有研究表明，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)在KOA 的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了KOA大鼠模型，觀察蠲痹湯加味對(duì)KOA 大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍、關(guān)節(jié)滑膜厚度和血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素 1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素9（IL-9）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、組織金屬蛋白酶抑制因子1（TIMP-1）水平的影響，探討其防治KOA的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量150 ～170 g，普通飼料喂養(yǎng)，飼料和大鼠均購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK（粵）2018-0094。

1.2藥物蠲痹湯加味組成：羌活15 g，獨(dú)活15 g，肉桂3 g，秦艽15 g，當(dāng)歸15 g，川芎15 g，炙甘草6 g，海風(fēng)藤15 g，桑枝15 g，乳香10 g，木香10 g，杜仲20 g，桑寄生20 g。中藥飲片均由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。將上述中藥飲片加8倍量的水浸泡30 min 后，煎煮40 min，取藥液過濾另存，再加6 倍量的水煎煮40 min 后取液過濾，將2 次藥液混合，于100 ℃濃縮至100 mL，相當(dāng)于原藥1.74 g，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩｛}酸氨基葡萄糖膠囊，浙江誠意藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20161024。

1.3試劑與儀器大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）試劑盒[齊一生物科技（上海）有限公司]；大鼠血清NO、MDA、SOD、TGF-β1、MMP-3、TIMP-1 ELISA 試劑盒（上海恒渡生物科技有限公司）。WT5003CH電子天平（常州萬泰天平儀器有限公司）；AXTG16G 臺(tái)式高速離心機(jī)（江蘇省鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SuPerMax 3000FA多功能酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；快進(jìn)千分尺（上海首豐精密儀器有限公司）；TESA 刻度量角器（上海尚銘計(jì)量儀器科技有限公司）。

1. 4動(dòng)物分組、造模與干預(yù)所有SD 大鼠給予普通飼料進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、蠲痹湯加味組、氨基葡萄糖組，每組各15 只。參照Panicker等[7]方法制備大鼠KOA模型：戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水0.2 mL 注射進(jìn)大鼠的右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，隔3 d注射1 次，連續(xù)注射3 次。2 周后即可獲得穩(wěn)定的KOA 模型。而正常組右膝關(guān)節(jié)腔注射等劑量的生理鹽水。獲得穩(wěn)定的KOA 模型后，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積等效量換算比例[8]計(jì)算大鼠的給藥劑量，蠲痹湯加味組給予蠲痹湯加味4.348 g·kg-1·d-1灌胃，氨基葡萄糖組給予鹽酸氨基葡萄糖膠囊86.400 g·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃8 周。8周后檢測指標(biāo)。

1.5實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測8 周后，最后一次給藥后禁食12 h 以上，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血10 mL，以3 000 r/min 離心20 min后取上清液，-70 ℃保存。采用ELISA法檢測大鼠血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9、NO、MDA、SOD、TGF-β1、MMP-3、TIMP-1的水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)度對(duì)麻醉狀態(tài)下的大鼠，用刻度量角器測量右膝關(guān)節(jié)在外力作用下伸展至回縮的角度。

1.7大鼠關(guān)節(jié)滑膜厚度打開大鼠右膝關(guān)節(jié)腔后刮取滑膜組織，用快進(jìn)千分尺測定關(guān)節(jié)滑膜厚度。

1.8統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)度和滑膜厚度的比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的關(guān)節(jié)活動(dòng)度顯著減小，關(guān)節(jié)滑膜厚度顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠的關(guān)節(jié)活動(dòng)度顯著增加，關(guān)節(jié)滑膜厚度顯著減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)活動(dòng)度和滑膜厚度的比較Table 1 Comparison of the joint mobility and synovial thickness in various groups （x ± s）

2. 2各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平的比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9水平的比較Table 2 Comparison of the serum TNF-α，IL-1β，IL-6 and IL-9 levels in various groups [x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.3各組大鼠血清NO、MDA、SOD水平的比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清NO、MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠血清NO、MDA水平顯著降低，SOD 水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且2 個(gè)治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表3 各組大鼠血清NO、MDA、SOD水平的比較Table 3 Comparison of the serum NO，MDA and SOD levels in various groups （x ± s）

2.4各組大鼠血清TGF-β1、MMP-3、TIMP-1水平的比較表4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清MMP-3 水平顯著升高，TGF-β1、TIMP-1水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，蠲痹湯加味組和氨基葡萄糖組大鼠血清MMP-3 水平顯著降低，TGF-β1、TIMP-1水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且2個(gè)治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清TGF-β1、MMP-3、TIMP-1水平的比較Table 4 Comparison of the serum TGF-β1，MMP-3 and TIMP-1 levels in various groups [x±s，ρ/（pg·mL-1）]

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）屬本虛標(biāo)實(shí)之病，本虛在于肝腎虧虛，標(biāo)實(shí)為風(fēng)、寒、濕、瘀痹阻。肝腎虧虛，正氣不足，不能抵抗外邪，風(fēng)、寒、濕邪合而侵襲，痹阻關(guān)節(jié)筋脈，致血行不暢，滯而成瘀，風(fēng)寒濕瘀痹阻，不通則痛，留注關(guān)節(jié)，致關(guān)節(jié)腫脹畸形，發(fā)為痹病[9]。因此，中醫(yī)治療此病以補(bǔ)益肝腎、散寒除濕、活血化瘀為主。蠲痹湯出自《醫(yī)學(xué)心悟》，具有散寒、除濕、祛風(fēng)等功效，本研究方藥在蠲痹湯基礎(chǔ)上加味而成。方中杜仲、桑寄生補(bǔ)益肝腎、壯筋強(qiáng)骨，肉桂補(bǔ)火助陽、散寒通脈，當(dāng)歸、川芎活血化瘀，當(dāng)歸兼有補(bǔ)血作用，活血而不傷正，乳香行氣活血、化瘀通脈，羌活、獨(dú)活散寒止痛、祛風(fēng)除濕，秦艽、海風(fēng)藤祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛，桑枝祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、止痹痛，甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)益肝腎、活血化瘀、祛風(fēng)除濕等功效。

關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶是最常用的KOA 大鼠模型造模方法，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用此方法建立了大鼠KOA 模型，結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9、NO、MDA、MMP-3水平明顯升高，SOD、TGF-β1、TIMP-1水平明顯降低，關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍減小，關(guān)節(jié)滑膜厚度增加（均P＜0.05）。提示KOA 大鼠模型造模成功，且KOA 大鼠存在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)降解等病理機(jī)制。

炎癥反應(yīng)是軟骨退變的主要原因之一，主要表現(xiàn)為TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9等炎癥因子水平升高。TNF-α 可以誘導(dǎo)骨母細(xì)胞釋放破骨細(xì)胞活化因子，促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收，同時(shí)促進(jìn)軟骨細(xì)胞釋放膠原酶，破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)[10]。IL-1β 可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌NO 和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[11]。IL-6可以促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，促進(jìn)骨吸收和成纖維細(xì)胞增殖，還可以促進(jìn)IL-1β 分泌MMPs，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解[12]。IL-9 參與骨髓樣白血病細(xì)胞系的增長，與關(guān)節(jié)血管增生密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，蠲痹湯加味可以降低KOA 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-9 水平，增加關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍和減小關(guān)節(jié)滑膜厚度。提示蠲痹湯加味可能通過抑制炎癥反應(yīng)從而改善KOA。

氧化應(yīng)激反應(yīng)在膝關(guān)節(jié)退變具有重要的作用。NO可以抑制軟骨細(xì)胞增殖、降低軟骨的修復(fù)能力，還可以促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解，加速軟骨破壞[14]。MDA 反映氧化損傷的嚴(yán)重程度，可以抑制軟骨細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解[15]。SOD反映機(jī)體的抗氧化程度，可以清除MDA 等氧自由基，修復(fù)損傷的關(guān)節(jié)軟骨[15]。本研究結(jié)果顯示，蠲痹湯加味可以降低KOA 大鼠血清NO、MDA 水平，提高SOD 水平，增加關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍和減小關(guān)節(jié)滑膜厚度。提示蠲痹湯加味可能通過降低KOA大鼠的氧化應(yīng)激從而改善KOA。

細(xì)胞外基質(zhì)的降解與合成在膝關(guān)節(jié)退變中同樣具有重要的作用。TGF-β1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化，可以抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)軟骨合成，抑制膠原和蛋白多糖的降解，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解，在關(guān)節(jié)修復(fù)和重建中起到重要的作用[16]。MMP-3 可以促進(jìn)軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的降解，激活膠原蛋白酶，從而促進(jìn)II 型膠原的降解，是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解的最重要因子[17]。TIMP-1 是MMP-3的特異性抑制因子，通過與MMP-3發(fā)生不可逆性結(jié)合，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蠲痹湯加味可以降低KOA 大鼠血清MMP-3 水平，提高 TGF-β1、TIMP-1 水平，增加關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍和減小關(guān)節(jié)滑膜厚度。提示蠲痹湯加味可能通過抑制KOA 大鼠關(guān)節(jié)腔的細(xì)胞外基質(zhì)降解從而改善KOA。

綜上所述，蠲痹湯加味可能通過抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)與軟骨基質(zhì)的降解，從而發(fā)揮防治KOA的作用。