滋陰補腎方對糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠病癥及骨代謝的影響

羅蒙， 江波， 徐鴻婕， 孫勤國， 呂琨， 楊倩， 張賢梅， 黃天慧

[1.武漢大學同仁醫院（武漢市第三醫院）中醫科，湖北武漢 430060）]

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，伴隨多種并發癥，其中糖尿病骨質疏松（diabetic osteoporosis，DOP）發病率最高[1]。骨質疏松的主要特征為骨量系統性減少、骨組織結構退化，致骨強度降低，骨脆性增加[2-3]。進入更年期的婦女由于卵泡數量明顯減少、卵巢功能低下、雌激素缺失和衰老的疊加作用，更易發生骨質疏松[4]。本課題組前期研究結果顯示，滋陰補腎方對糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠具有較好的治療效果[5]，本次研究在已有研究成果的基礎上，從糖尿病病癥及骨代謝方面探討滋陰補腎方的治療作用，以期為DOP 臨床藥物的開發應用提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1實驗動物60 只 SPF 級雌性 SD 大鼠，3 月齡，體質量（252 ± 18）g，購于湖北省疾病預防控制中心，動物質量合格證號：42000600025698。飼養于華中農業大學實驗動物中心，溫度為23 ℃、濕度為60%左右，自然光源的環境中適應性喂養動物1周后進行造模。

1. 2藥物、試劑與儀器滋陰補腎方由生龍骨30 g、生牡蠣30 g、桑寄生10 g、續斷10 g、淫羊藿10 g、天花粉10 g、黃連10 g組成，以上中藥材均購自同仁醫院中藥房，經過中藥傳統方法浸泡、煎煮、過濾、濃縮制成煎劑。骨化三醇軟膠囊由正大制藥（青島）有限公司生產（批號：1703211；規格：0.25 μg/粒）。高糖高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司；大鼠糖化血紅蛋白A1c（HbA1c）、胰島素（INS）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。352 型酶標儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司）；URIT-8031 全自動生化分析儀（桂林優利特電子集團有限公司）。

1.3分組、模型構建與給藥將60只大鼠隨機分為正常組，模型組，骨化三醇組，滋陰補腎方低、中、高劑量組，每組10 只。除正常組外，其他5 組大鼠均建立DOP 模型，造模方法：腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉大鼠成功后，仰臥位固定，常規消毒。無菌條件下于大鼠最末肋骨下腋中線至脊柱外側約1 cm 處備皮，切開皮膚、肌肉和腹膜，輕輕拉出脂肪團暴露卵巢，結扎卵巢下端輸卵管，摘除雙側卵巢。止血后，逐層縫合，關腹，縫合切口，外敷消炎粉。術后正常喂養，切口每日消毒[6]。進食高糖高脂飼料（配方：普通飼料中按質量分數添加20%蔗糖、15%熟豬油、10%蛋黃粉）14 d，禁食12 h 后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg。取大鼠尾血測定空腹血糖值＞16.7 mmol/L，同時蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠脛骨骨小梁病理變化，判定模型是否構建成功[6-7]。造模同期，正常組給予普通飼料喂養。造模成功后，骨化三醇組給予骨化三醇混懸液（以生理鹽水溶解）0.1 μg·kg-1·d-1灌胃；滋陰補腎方低、中、高劑量組分別按人與大鼠給藥換算比計算分別相當于生藥量5、10、20 g·kg-1·d-1（體質量）[5]給予滋陰補腎方灌胃；正常組與模型組大鼠進行等量生理鹽水灌胃。灌胃給藥8 周，每日1 次。給藥期間，正常組繼續普通飼料喂養，其他各組繼續高糖高脂飼料喂養。

1. 4血糖、堿性磷酸酶（ALP）、鈣、磷及尿糖等生化指標的測定采用自動生化分析儀檢測大鼠血糖、ALP、鈣、磷及尿糖水平。

1.5 ELISA法檢測大鼠血清空腹胰島素、HbA1c水平根據ELISA 試劑盒說明書操作。應用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度，計算胰島素濃度、HbA1c含量。

1.6胰島素抵抗指數生化檢測空腹大鼠血糖水平，計算胰島素抵抗指數。胰島素抵抗指數=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.7統計方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。所有數據均以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1滋陰補腎方對胰島素敏感指數的影響圖1結果顯示：與正常組比較，模型組空腹血糖、胰島素水平以及胰島素抵抗指數顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，骨化三醇組，滋陰補腎方低、中、高劑量組大鼠空腹血糖、胰島素水平以及胰島素抵抗指數顯著降低（P＜0.05），且各治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2滋陰補腎方對糖尿病癥指標的影響圖2 結果顯示：與正常組比較，模型組的血糖、尿糖、HbAlc 水平顯著升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，骨化三醇組，滋陰補腎方低、中、高劑量組的血糖、尿糖、HbAlc 水平顯著降低（P＜0.05），且各治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3滋陰補腎方對骨代謝生化指標的影響圖3結果顯示：與正常組比較，模型組的ALP、鈣、磷水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，骨化三醇組，滋陰補腎方低、中、高劑量組的ALP、鈣、磷水平顯著升高（P＜0.05），且各治療組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。

圖1 各組大鼠空腹血糖（A）、胰島素（B）及胰島素抵抗指數（C）水平比較Figure 1 Comparison of the levels of fasting blood glucose（A），insulin（B）and insulin resistance index（C）in rats of various groups

圖2 各組大鼠血糖（A）、尿糖（B）及HbAlc（C）含量比較Figure 2 Comparison of the levels of blood glucose（A），urine glucose（B）and HbAlc（C）in rats of various groups

圖3 各組大鼠磷（A）、鈣（B）含量及ALP活性（C）比較Figure 3 Comparison of phosphorus（A）and calcium（B）contents and ALP activity（C）in rats of various groups

3 討論

葡萄糖是促進機體胰島細胞分泌胰島素的關鍵物質，在一定范圍內，由于反饋調節的作用，胰島素水平與血糖的升高呈正相關，即血糖短時間的增加可刺激胰島素的分泌。但如果血糖升高至一定程度后，持續的高血糖不僅不能促進胰島素的分泌，還會導致胰島功能受損，并引起胰島β 細胞調亡，促使胰島β細胞加速衰退，進而加重胰島素分泌不足的情況，促使高血糖的發生，形成惡性循環，即為葡萄糖毒性作用[8-9]。如果積極有效地控制血糖，則葡萄糖毒性作用可減輕甚至消失。空腹血糖和HbAlc能反映機體的胰島β細胞功能和胰島分泌功能[10]。本研究結果顯示，滋陰補腎方低、中、高劑量組的血糖、尿糖、HbAlc水平顯著低于模型組（P＜0.05），提示滋陰補腎方能顯著改善糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠的糖耐量，減輕糖尿病癥狀，提高胰島分泌功能。

胰島素敏感性的經典評估方法為穩態模式評估法胰島素抵抗指數（HOMA-IR），可用來評估糖尿病患者的胰島素抵抗程度[11]。胰島素抵抗對骨密度存在一定的影響，Prado 等[12]的研究結果表明，胰島素抵抗可加重骨量的丟失，是骨質疏松發生的危險因素。呂燕等[13]研究結果也顯示胰島素抵抗可促使糖尿病腎病的發生，并導致骨代謝異常，加重糖尿病患者骨量的丟失。本研究結果顯示，經滋陰補腎方處理后，滋陰補腎方低、中、高劑量組大鼠胰島素抵抗指數顯著低于模型組（P＜0.05），表明滋陰補腎方可能通過提高糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠胰島素抵抗指數，緩解骨量的丟失。

此外，可以根據骨代謝的生化標志物來了解骨代謝情況，判斷骨的轉換情況[14-15]。血清中的ALP水平可以反映成骨細胞的功能，是骨生成的標志物，通常可以表示骨的生成量[16]。鈣和磷是反映骨吸收的指標，對骨質疏松的發生程度具有指導意義。本研究結果顯示，滋陰補腎方低、中、高劑量組的ALP、鈣、磷水平較模型組顯著升高（P＜0.05），提示滋陰補腎方可改善糖尿病合并去卵巢骨質疏松大鼠的骨代謝。

糖尿病骨質疏松癥（DOP）屬于中醫“消渴”“骨痿”的范疇。滋陰補腎方基于“腎主骨”理論，從滋陰補腎入手，益氣養陰、滋腎壯骨[17]，可顯著改善DOP 大鼠的糖耐量，減輕糖尿病癥狀，提高胰島分泌功能，并改善骨代謝。鑒于滋陰補腎方在DOP 治療中具有潛在應用前景，后續將進一步深入探討，為其推廣應用提供更多的基礎資料。