心脈康方對兔動脈粥樣硬化及NF-κB p65 表達的影響

王婷， 葉小漢， 吳錦波， 馮文偉

（東莞市中醫院心內科，廣東東莞 523000）

動脈粥樣硬化是缺血性心腦血管病的主要病理基礎[1-3]。血管內皮細胞功能受損是動脈粥樣硬化的始動環節[4]。干預血管內皮功能紊亂成為治療動脈粥樣硬化的新靶點之一。動脈粥樣硬化的基本特征是動脈管壁的增厚變硬，管腔縮小，斑塊形成甚或血栓形成，這和中醫“積證”診斷要點是一致的[5]。根據中醫積證的理論思想，葉小漢教授提出用軟堅散結法對動脈粥樣硬化進行防治，研發了心脈康方，多年的臨床實踐證實心脈康對動脈粥樣硬化具有明顯的防治作用[6-9]。前期動物實驗亦表明，心脈康有明顯的抗家兔動脈粥樣硬化形成的作用，可降低血脂、減輕過氧化損傷。基于此，本研究進一步觀察心脈康方對兔動脈粥樣硬化的干預作用及其可能機制，探討心脈康對動脈粥樣硬化兔血管內皮功能的保護作用，以期為臨床應用提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物47只普通級5月齡雄性新西蘭兔，體質量1.8 ～2.3 kg，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：44007600005584。普通級動物實驗室，溫度20 ～26 ℃，濕度40% ～70%，晝夜明暗交替（12 h/12 h）。

1.2藥物與試劑心脈康片（東莞市中醫院院內制劑，批號：粵藥制字Z20110041）；辛伐他汀片（美國默沙東公司，批號：R018651）。BCA-100蛋白定量分析試劑盒、總蛋白提取試劑，均購于上海博彩生物科技有限公司；預染蛋白分子量Marker（美國Thermo Scientific Pierce 公司）；NF-κB p65抗體（英國Cohesion Biosciences公司）。

1.3主要儀器TGL-16 臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室開發有限公司）；VE-180A微型垂直電泳槽（上海天能科技有限公司）；LEO-1430VP掃描電子顯微鏡（德國里奧有限公司）；BMK-500 光鏡（重慶奧特光學顯微鏡有限公司）；JS-680A自動凝膠成像分析儀器（上海培清科技有限公司）。

1.4動物模型建立[10]、分組與給藥將37只新西蘭兔普通飼料喂養2 周后，隨機分為假手術組10只、模型組8只、心脈康組9只、辛伐他汀組10只。動脈粥樣硬化模型建立方法：模型組、心脈康組、辛伐他汀組大鼠均喂食高脂飼料（按質量分數配比，即1%膽固醇、5%豬油、94%基礎飼料）。高脂喂養2 周后，再行腹主動脈內膜球囊損傷術：取30 g/L 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經耳緣靜脈注射麻醉動物后，穿刺右股動脈，沿0.014 導絲將內徑為3.5 mm、長15 mm 的球囊導管送入腹主動脈約20 cm，8 個大氣壓充盈球囊并緩慢回拉球囊平切口處，反復回拉3次，以造成腹主動脈內膜損傷和剝脫。假手術組大鼠給予普通飼料喂養，只分離結扎股動脈，不拉傷腹主動脈內皮。所有動物均手術成功。術后，辛伐他汀組給予辛伐他汀2.60 mg·kg-1·d-1灌胃，心脈康組給予心脈康片0.21 g·kg-1·d-1灌胃，假手術組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。持續12 周。

1.5觀察指標與方法

1.5.1 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察兔腹主動脈組織病理變化 取兔腹主動脈組織，40 g/L多聚甲醛溶液固定組織48 h。梯度乙醇脫水，二甲苯透明4 h，石蠟包埋，切片厚 4～5 μm，60 ℃溫箱中烤片。HE 染色，在400 倍光鏡下觀察腹主動脈組織的形態結構并采圖。

1.5.2 掃描電鏡觀察腹主動脈內壁 取腹主動脈段，用pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗表面后，快速放入體積分數為2.5%的戊二醛固定液中固定，再用PBS 清洗，然后將腹主動脈血管放入體積分數1%鋨酸固定液，用PBS 清洗4 次。將徹底清洗干凈的腹主動脈血管放入酒精中脫水后放入臨界點干燥儀中干燥，再放入真空鍍膜儀中鍍膜，在掃描電子顯微鏡下觀察血管內壁情況。

1.5.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測兔腹主動脈組織NF-κB p65表達 制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：按照試劑盒說明書和抗體條帶大小來統一配制12%分離膠、5%濃縮膠；蛋白樣品準備：定量后的蛋白樣品按比例（1∶4）加入上樣buffer（5×）混勻，沸水煮5 min使蛋白變性；加樣：預電泳后依次加入標準品（Marker）和待分析樣品；電泳；切膠；按正極、海綿、三層濾紙、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、凝膠、三層濾紙、海綿、負極的順序，恒流300 mA/h 進行轉膜；膜封閉；一抗孵育：按說明書推薦的倍數稀釋一抗，4 ℃過夜；用TBST 洗滌膜10 min，3 次；二抗孵育：二抗稀釋1∶15 000，室溫搖床（50 r/min）孵育1 h；TBST洗滌膜10 min，3次；電化學發光（ECL），顯影，定影；將膠片進行掃描或拍照，用JS-680A 自動凝膠成像分析儀器中SensiAnsys軟件進行目的條帶的灰度分析。

1. 6統計方法采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析。進一步兩兩比較，若方差齊用LSD 法，若方差不齊則用Dunnett’s 法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組兔主動脈組織HE染色病理變化比較圖1結果顯示：假手術組動脈內膜可見內皮細胞，可見內彈性膜和中膜的彈性纖維和平滑肌纖維；模型組動脈內膜下可見一層厚厚的粥樣硬化斑塊，斑塊中可見巨噬細胞吞噬脂肪形成的泡沫細胞，表面可見少量炎性細胞和淋巴細胞浸潤，管腔變窄，中膜變??；心脈康組動脈內膜下可見一層巨噬細胞吞噬脂肪的泡沫細胞，粥樣硬化斑塊表面未見纖維層，有炎性細胞浸潤；辛伐他汀組動脈內膜下可見一層巨噬細胞吞噬脂肪的泡沫細胞，粥樣硬化斑塊表面可見一薄的纖維層，有炎性細胞浸潤。

各組兔主動脈組織病理變化比較結果顯示，與假手術組比較，模型組兔主動脈粥樣斑塊明顯形成，內膜明顯增厚，內膜下大量泡沫細胞聚集及炎性細胞浸潤，符合動脈粥樣硬化病理學改變，說明動脈粥樣硬化模型復制成功。治療后，與模型組比較，心脈康組和辛伐他汀組內膜增厚的厚度，內膜下泡沫細胞聚集和炎性細胞浸潤均有不同程度的減輕。

圖1 各組兔主動脈組織病理變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the pathological changes of aorta tissue in various groups（by HE staining，×400）

2.2各組兔主動脈內壁掃描電鏡結果比較圖2結果顯示：假手術組血管內壁光滑，內皮細胞未見腫脹及損傷，未見粥樣硬化斑塊及泡沫細胞。模型組血管內粥樣硬化斑塊明顯向內膜凸起，可見損傷的內皮細胞，在硬化斑塊上可見粘附的巨噬細胞。心脈康組血管內壁不光滑，可見許多小的粥樣硬化斑塊，未見明顯損傷的內皮細胞。辛伐他汀組血管內壁不光滑，少量內皮細胞損傷，血管表面可見小的粥樣硬化斑塊。

圖2 各組兔主動脈內壁病理變化比較（掃描電鏡，×500）Figure 2 Comparison of the pathological changes in inner wall of aorta in various groups（by scanning electron microscopy，×500）

各組兔主動脈內壁掃描電鏡結果比較：假手術組兔主動脈內膜由一層完整的內皮細胞構成；模型組兔血管內皮受損，動脈粥樣硬化斑塊明顯形成；心脈康組和辛伐他汀組內皮細胞較完整，動脈粥樣硬化均有改善。

2.3各組兔主動脈組織NF-κB p65蛋白表達水平比較圖3、表1 結果顯示：與假手術組比較，其他各組的 NF-κB p65 表達水平均升高（P＜ 0.01）；與模型組比較，心脈康組的NF-κB p65 表達水平均降低（P＜0.01）；而辛伐他汀組主動脈組織NF-κB p65 表達水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明心脈康方可抑制動脈粥樣硬化兔主動脈組織NF-κB p65 表達，效果優于辛伐他汀片。

圖3 各組NF-κB p65的Western Blot電泳條帶Figure 3 Comparison of Western Blot strips of NF-κB p65 in various groups

表1 各組兔主動脈組織NF-κB p65蛋白相對表達水平的比較Table 1 Comparison of the relative expression level of NF-κB p65 in the rabbit aorta tissue in various groups （x ± s）

3 討論

東莞市中醫院葉小漢主任醫師從動脈粥樣硬化的病理學改變中得到啟發，發現動脈粥樣硬化無論是斑塊的形成期、穩定期，還是破裂期，其局部微觀變化均與中醫“積證”相類似，為有形、固定不移之物，病位在血分，系痰瘀交結所致，故認為動脈粥樣硬化屬于中醫“積證”病變，創制心脈康。心脈康由鱉甲、三棱、莪術、枳實、制膽星和石斛等組成。其中：鱉甲為君藥，行軟堅散結之功；三棱、莪術為臣藥，破血行氣，消積止痛；枳實、制膽星、石斛為佐藥，具有行氣、化痰、散結等功效。諸藥合用，共奏軟堅散結、益氣通脈之功。本研究通過喂食兔高脂飼料2周后行腹主動脈內膜球囊損傷術建立動脈粥樣硬化模型，HE染色及電鏡結果顯示：模型組血管內皮可見許多粥樣硬化斑塊，在斑塊表面可見纖維帽、泡沫細胞及粘附的巨噬細胞，亦可見損傷的內皮細胞。與模型組比較，心脈康組和辛伐他汀組內膜增厚的厚度，內膜下泡沫細胞聚集、炎性細胞浸潤及內膜細胞受損均有不同程度的減輕。表明心脈康可有效減輕動脈粥樣硬化兔血管內皮病理損傷。

血管內皮細胞可表達多種血管活性物質，調節血管生理功能，其中血管活性物質NF-κB 與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關。NF-κB 的活化和表達是動脈粥樣硬化損傷的一個重要樞紐，是動脈粥樣硬化形成和進展的重要因素[11]。NF-κB是1986年Sen 和Baltimore 首先從B 淋巴細胞核提取物中檢測出的一種蛋白因子[12]。NF-κB 家族包括了RelA（p65）、RelB、c-Rel、NF-κB1（p105-p50）和NF-κB2（p100-p52）等5個成員。p50及p65 異源二聚體是NF-κB 所有形式中含量最高，也是最重要的一種[13]。在動脈粥樣硬化的斑塊中已證實NF-κB的存在[14]。NF-κB可通過調控多種細胞因子、趨化因子、黏附因子、急性期反應蛋白，并參與炎癥反應的酶的基因表達[15-16]。NF-κB 信號通路是由細胞因子介導的經典信號轉導通路，不僅參與炎癥反應，也調控氧化應激、內皮細胞損傷、平滑肌增殖遷移、血管細胞凋亡等過程[17]，貫穿于動脈粥樣硬化起始及進展的各個時期。NF-κB 的激活會上調血管細胞黏附因子1（VCAM-1）、細胞間黏附分子1（ICAM-1）和內皮細胞白細胞黏附分子1（ELAM-1）的表達以介導單核細胞黏附內皮細胞并移動向內皮下；而阻斷NF-κB 信號通路能下調細胞因子誘導的黏附因子的表達[18]?？梢姡琋F-κB活化可促進動脈粥樣硬化的形成、發展，抑制NF-κB有利于抗動脈粥樣硬化。本研究結果顯示：動脈粥樣硬化模型兔主動脈組織NF-κB p65 表達明顯升高，給予心脈康治療后NF-κB p65 水平明顯降低。說明心脈康可能通過下調NF-κB p65 表達減輕動脈粥樣硬化。

綜上所述，心脈康可改善兔動脈粥樣硬化，保護血管內皮功能，其機制可能與下調主動脈組織NF-κB p65表達有關。