基于網絡藥理學和分子生物學探討溫下方治療肺癌的作用機制

周瑩， 張韌， 黃意勉， 廖錦彬， 余泳儀， 羅海燕， 黃少偉

（1.廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州 510006；2.廣東省第二中醫院/廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東廣州 510095）

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率在我國居于惡性腫瘤之首，現仍有不斷上升的趨勢，死亡率居高不下，約80%的患者就診時已屬中晚期，化療為其主要治療手段，但成功率普遍不高[1-3]。中藥具有多成分、多靶點、整體調節的作用特色，應用中醫辨證論治治療肺癌，在穩定病灶、延長生存時間、改善生存質量等方面具有一定的優勢[4]。本課題組查閱文獻[5-7]，篩選出人參、大黃、附子、當歸等4味中藥為治療肺癌的常用藥物，但其具體作用機制尚不明確。網絡藥理學是基于系統生物學、多向藥理學等學科的發展及網絡數據庫的完善，對生物系統進行網絡構建，通過高通量篩選、網絡分析等技術構建“藥物-成分-基因-疾病”之間復雜網絡信號關系的新興學科[8]。為進一步探討人參、大黃、附子、當歸所組成的溫下方治療肺癌的物質基礎及分子機制，本研究擬通過網絡藥理學進行靶點預測，以期為臨床治療肺癌提供新思路及有效方藥，同時也為后續的實驗研究提供基礎，現將研究結果報道如下。

1 溫下方的網絡藥理學機制

1.1資料與方法

1.1.1 藥物成分-靶點網絡構建 將溫下方藥物名稱“大黃”“附子”“當歸”“人參”輸入到TCMSP 數據庫（http：//Isp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），使用口服生物利用度值（Degree）大于20%和藥物相似性評價值大于0.18 的限定條件對得到的藥物活性成分進行篩選，得到藥物的有效活性成分。利用Uniport 數據庫的靶點分子名稱（Molecule Name）選項，獲得靶點基因名（Gene Symbol）。通過Cytoscape軟件進行藥物成分-靶點的網絡構建。

1.1.2 肺癌疾病的相關靶點檢索 利用TTD數據庫（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）進行肺癌的相關靶點檢索，并利用Uniport 數據庫得到相對應的基因名。

1.1.3 溫下方藥物活性成分靶點與肺癌疾病靶點的蛋白質相互作用關系網絡構建及基因本體論（GO）注釋與京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析 將溫下方藥物有效成分靶點的基因名輸入到String 數據庫（https：//string-db.org/），得到蛋白質相互作用關系數據。同法，得到肺癌疾病靶點的蛋白質相關作用關系數據。分別將上述數據導入到Cytoscape 軟件，得到活性成分靶點和肺癌疾病靶點的蛋白質相互作用關系網絡。將這2個網絡進行合并，得到藥物有效成分靶點與肺癌疾病靶點的蛋白質相互作用關系網絡。利用該網絡中所有靶點的Degree 值，得到溫下方藥物有效成分靶點與肺癌疾病靶點的蛋白質相互作用關系網絡中重要靶點的信息。通過DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/），對篩選出來的重要靶點進行GO注釋和KEGG通路分析。

1.2結果

1.2.1 溫下方活性成分與成分靶點網絡 從TCMSP數據庫篩選出的溫下方有效活性成分有107種，其中大黃有29 種成分，附子有27 種成分，當歸有4 種，人參有47 種成分。將有效活性成分輸入到TCMSP數據庫中，得到成分靶點共112個。由于有些成分靶點同時能夠被多種成分結合，而一個成分同時能夠與多種成分靶點結合，而有些有效成分卻沒有相應的結合靶點，最后獲得32 個成分有其相對應的作用靶點。見表1。

利用Cytoscape 軟件構建藥物-成分和成分-靶點網絡，見圖1 和圖2。圖1 共涉及35 個節點，34 條邊。藍紫色六邊形代表溫下方組成藥物，粉紫色六邊形代表32 個藥物活性成分，邊代表藥物與活性成分之間的關聯。圖2 共涉及172 個節點，604條邊。六邊形代表藥物活性成分，圓圈代表成分靶點，邊代表成分與成分靶點之間的關聯。

1.2.2 肺癌相關靶點信息 從TTD數據庫里收集到有關肺癌的疾病靶點一共有77 個：TPBG、MMP2、MMP9、ALK、PDGFRA、BCL2、BIRC5、FGFR1、PDGFRB、 BRAF、 CEACAM5、 CDK1、 CDK7、CDK9、CDK4、COX17、DRD2、TOP1、MAP2K1、HSP90B1、 EGFL7、 EGFR、 FANCF、 HPSE、HGF、 HDAC1、 IGF1R、 ITGB1、 IL2、 IL4R、MMP1、KIF11、KDM1A、CSF1、MMP12、MARK3、MMP7、MAGEA3、MAGEC1、MAGEC2、MAD1L1、BAD、CLU、EIF4E、HSPB1、PRKCA、OPRM1、NTSR1、 NFE2L2、 CTAG1A、 P2RY2、 PDCD1、PPARG、PECAM1、FNTB、FNTA、ABL1、RET、AKT1、ERBB2、ERBB3、CHEK1、PLK1、ALB、SSTR2、 SKP2、 S1PR1、 TYMS、 TLR9、 TUBB3、PRAME、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TUSC2、MDM2、FLT1、KDR。

表1 溫下方有效活性成分Table 1 Active compounds in Warm Purgative Recipe

圖1 溫下方成分網絡Figure 1 The ingredient network of Warm Purgative Recipe

圖2 溫下方成分-靶點網絡Figure 2 The ingredient-target network of Warm Purgative Recipe

1.2.3 溫下方藥物有效成分靶點與肺癌疾病靶點的蛋白質相互作用關系網絡的分析 通過Cytoscape軟件，獲得成分靶點-疾病靶點的蛋白質相互作用關系網絡。見圖3。圖3 共涉及170 個節點，1 145 條邊。圓圈大小和顏色深淺代表靶點蛋白相互作用的密切程度，橘紅色圓圈節點代表符合篩選條件的39 個重要靶點。邊代表靶點間的相互關聯，節點大小代表Degree 值的大小，節點越大，對應的Degree 值越大。

圖3 溫下方與肺癌蛋白質相互作用網絡Figure 3 Proteins interaction network of Warm Purgative Recipe against lung cancer

1.2.4 39 個重要靶點的GO 注釋與KEGG 通路分析 收集到39個重要靶點經過GO注釋與KEGG通路分析后，按P值從小到大排序，取前20個GO注釋信息（包括前20 個生物過程注釋，前20 分子功能注釋，前20個細胞組成注釋）和前20條KEGG通路信息，具體見圖4 ～7 和表2。在圖中，圓圈的大小代表參與該生物過程，或該分子功能，或該細胞組成，或該通路的靶蛋白基因數目的多少，圓圈越大，基因數目越多；顏色代表P值的大小，顏色由綠變紅對應的P值越大；Rich factor 和P值代表靶蛋白基因的富集程度，Rich factor 和P值越大，富集程度越高。

2 細胞驗證實驗

2.1材料與方法

2.1.1 細胞來源及培養 人屬非小細胞肺癌A549細胞株，購自國家實驗細胞資源共享平臺。將非小細胞肺癌A549 細胞培養在含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基，置于37 ℃，體積分數5%CO2的細胞培養箱中培養。

圖4 重要靶點GO注釋——生物過程Figure 4 GO enrichment analysis of key targets—biological processes

圖5 重要靶點GO注釋——細胞組成Figure 5 GO enrichment analysis of key targets—cellular components

2.1.2 試劑與儀器 四甲基偶氮唑鹽（MTT）（德國Biofroxx 公司）；UNIQ-10 柱式 TRIzol 總 RNA 抽提試劑盒（上海生工生物公司）；GeneRuler DNA Ladder Mix、 Maxima Reverse Transcriptase（美 國Thermo Scientific 公司）。全波長掃描多功能酶標儀（上海美谷子儀器有限公司）；StepOne 型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

圖6 重要靶點GO注釋——分子功能Figure 6 GO enrichment analysis of key targets—molecular functions

圖7 重要靶點KEGG通路分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis of key targets

表2 KEGG通路靶點信息Table 2 Data of KEGG pathway targets

2. 1. 3 含藥血清的制備 SPF 級雄性SD 大鼠10 只，體質量（200±20）g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號：SCXK（粵）2013-0034。實驗室常規條件下飼養。溫下方組成為人參30 g、大黃40 g、附子40 g、當歸20 g。中藥材購于廣州金芝中藥飲片有限公司。2 次水煎、濃縮制成含生藥量為1 g/mL 的藥液。大鼠給藥前稱質量，按照每只大鼠1 mL/100 g 灌胃，每天2 次，連續4 d，末次給藥前禁食不禁水12 h。末次給藥1 h后麻醉、腹主動脈采血，分離血清，水浴滅活，微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃冰箱保存備用。用上述含藥血清和RPMI 1640培養基分別配制體積分數5%、10%、20%的含藥血清。同法，給予大鼠生理鹽水灌胃制備空白血清。

2. 1. 4 MTT 實驗 取對數生長期的A549 細胞以每孔3 000個細胞接種于96孔板，待細胞融合度為70%左右時，吸去培養液，分別加入5%、10%、20%含藥血清，每個濃度設8個復孔，并設置空白對照組，放入培養箱中培養。48 h后，加入20 μL的MTT后，37 ℃孵育4 h，吸去培養液，加入100 μL DMSO 溶液，應用酶標儀于490 nm 波長處測定吸光度值。

2.1.5 熒光定量PCR 按照UNIQ-10 柱式TRIzol總RNA 抽提試劑盒的操作說明抽提各組細胞總RNA。AKT 上游引物序列5’- GAGGATGCCAAGG AGATCAT-3’，下游引物序列5’- CTGTGCCACT GGCTGAGTAG-3’；β-actin 上游引物序列5’-CC TCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物序列5’-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’。逆轉錄合成cDNA。將制備好的cDNA 進行熒光定量PCR 擴增，反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，45個循環。作熔解曲線，所有數值與內參（β-actin）作△Ct，以2-△△Ct法分析AKT 的mRNA表達水平。

2.1.6 統計方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05作為差異有統計學意義。

2.2結果

2.2.1 溫下方對A549細胞增殖的影響 表3結果顯示：與空白血清組比較，5%、10%、20%含藥血清組A549 細胞抑制率增加，差異有統計學意義（P＜0.05），且具有濃度依賴性。

2. 2. 2 溫下方對A549 細胞AKT mRNA 水平的影響 圖8 結果顯示：與空白血清組比較，10%、20%含藥血清組A549 細胞AKT mRNA 水平降低（P＜0.05），且具有濃度依賴性。

表3 溫下方對A549細胞增殖的影響Table 3 Effects of Warm Purgative Recipe on proliferation viability of A549 cells （x ± s，N=8）

圖8 溫下方對A549細胞AKT mRNA 表達水平的影響（x± s，N=8）Figure 8 Effects of Warm Purgative Recipe on AKT mRNA expression level in A549 cells（x ± s，N=8）

3 討論

肺癌的形成與陽氣不足、寒凝瘀滯有關，如《靈樞·百病始生篇》云：“積之始生，得寒乃生，厥乃成積矣。”[5]溫下方由附子、大黃、人參、當歸等4味中藥組成。附子溫散寒凝，宣通冷積，補火助陽；大黃瀉下通便，蕩滌里實，活血袪瘀；人參大補元氣，補脾益肺；當歸補血活血，調經止痛，潤燥滑腸。四藥合用，共成溫通寒積之劑，針對陽虛陰盛、邪毒內結之肺癌，恰對病機[5]。

本研究分析了溫下方各味中藥的有效成分，構建化合物-靶點網絡，分析化合物與靶點的相互作用關系。其中，化合物-靶點網絡中的關鍵藥物是β-谷甾醇、山柰酚、延胡索乙素、豆甾醇、大黃素等。β-谷甾醇是大黃、人參、當歸中的有效成分，山柰酚和延胡索乙素是人參的有效成分，豆甾醇是人參、當歸中的有效成分，大黃素是大黃中的有效成分。藥理學研究表明：β-谷甾醇通過調節VEGF的表達，對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用[9]，還能調節人肺癌A549 細胞增殖及凋亡[10]；山柰酚抗腫瘤作用明顯，高攝入山柰酚會降低晚期大腸腺瘤的復發，體外實驗表明，山柰酚對小鼠黑色素瘤細胞B16 具有增殖抑制作用[11]；延胡索乙素在體外可抑制惡性膠質瘤細胞U251MG的增殖、促進凋亡，在體內顯著抑制惡性膠質瘤組織增長，延長荷瘤小鼠生存時間[12]；豆甾醇具有抑制人肝癌細胞SMMC-7721 的增殖和誘導細胞凋亡的作用[13]；大黃素處理A549 細胞后，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶（p-AKT）、Bcl-2的表達量明顯減少，Bad 和cleaved-caspase-3 的表達水平明顯增加，大黃素通過調控AKT 信號傳導途徑誘導人肺癌A549細胞的凋亡[14]。

本研究通過藥物有效成分靶點與肺癌疾病靶點的蛋白質相互作用關系網絡的分析得到了39 個重要靶點。通過GO功能富集和KEGG 通路富集分析，發現了大多數的基因富集到了與癌癥有直接關系的通路上，包括癌癥通路、癌癥蛋白多糖通路、非小細胞肺癌等，另一大部分主要調控信號通路，包括PI3K-AKT 信號通路、雌激素信號通路、TNF信號通路等。經查閱文獻，本研究重點討論已經實驗或文獻報道驗證了的AKT1、Bcl-2、TP53、CDK1 靶點。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，亦稱蛋白激酶B（PKB），由3 種同種型（AKT1，AKT2 和AKT3）組成，在主要細胞功能中起關鍵作用，包括細胞大小、細胞周期進程、葡萄糖代謝調節、基因組穩定性、轉錄、蛋白質合成和新血管形成等。AKT 通過介導的細胞生長因子，并通過促凋亡蛋白的失活阻斷細胞凋亡促進細胞存活[15-19]。Bcl-2 這一基因家族主要與細胞凋亡有關，可以調控線粒體膜通透性，釋放凋亡因子細胞色素C 和激活Caspase 級聯反應等，是細胞凋亡過程中重要的調控因子[20]。TP53 基因是重要的抑癌基因之一，其編碼的腫瘤抑制蛋白p53 能夠使許多基因保持其穩定性，并調節細胞的生長、分化、衰老，避免疾病產生，被稱為“基因守護者”[21]。其編碼的p53 蛋白是一種應激反應蛋白，可以通過調節基因轉錄來應對基因毒性應激、癌基因信號激活以及DNA 損傷等不利因素[22]。周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）是調控細胞周期的核心分子，對細胞周期的調控至關重要。研究發現，肺癌、上皮性卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤中CDK1 功能失調，是腫瘤發生和發展的重要因素[23]。

為進一步驗證溫下方治療肺癌的作用靶點，本研究觀察了溫下方含藥血清對A549 細胞AKT mRNA水平的影響，結果顯示：溫下方含藥血清能顯著抑制A549細胞的增殖，可下調AKT mRNA 表達水平，且呈濃度依賴性。

綜上所述，溫下方具有多成分-多靶點-多途徑的作用特點。由于人力、物力等條件限制，本研究細胞驗證實驗只做了AKT 靶點，其他未驗證的靶點留待后續研究進行。