三白草化學成分與藥理作用研究進展及質量標志物預測分析

隨家寧,李芳嬋,郭勇秀,魏博偉,蔣 林,2,3,*

(1.廣西中醫藥大學,廣西南寧 530200;2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心,廣西南寧 530200;3.廣西高校中藥制劑共性技術研發重點實驗室,廣西南寧 530200)

三白草(Saururuschinensis(Lour.)Baill)為三白草科(Saururaceae)三白草屬(Saururus)植物,地上部分、根莖和全草皆可入藥,主產于中國南部地區,《唐本草》、《本草綱目》、《本草拾遺》等古籍中皆有收載[1]。2015版藥典收載三白草藥用部位為干燥的地上部分,全年均可采,其中僅以木脂素類三白草酮為指標成分,表明其含量不得少于0.10%。性味甘、辛,寒。歸肺、膀胱經。具有利水消腫、清熱解毒的效用,主治炎癥、泌尿系統疾病和女性帶下病[2]。現代藥理研究表明,三白草含木脂素類、黃酮類、揮發油類和多糖類等成分,主要藥理活性為保肝、中樞神經抑制、抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗病毒[3-5]。三白草作為民間常用草藥,歷史悠久,在臨床治療上發揮了重要作用。近年來,三白草的研究日益增多,但其成分多且復雜,質量與來源、產地、采收、加工過程等息息相關。中藥是通過多指標多靶點發揮協同整體臨床效應,僅靠指標成分或者單一標準把控中藥質量,已難以滿足行業需求[6],故對于三白草的質量把控方面,可選擇多種藥效成分作為指標成分。

本文總結歸納三白草化學成分和藥理作用,基于質量標志物概念原則,從親緣性及特有性、傳統藥效、新的藥效、可測性、傳統藥性、入血成分,預測分析壯藥三白草質量標志物評價指標,以期為準確控制三白草藥材、飲片及制劑的內在質量提供科學依據。查閱文獻時,尚有報道三白草有致模型小鼠死亡情況[7],且發現三白草具有毒性,應對此加以重視。

1 化學成分

三白草植物含多種成分,主要為木脂素類、黃酮類、揮發油類、生物堿類、多糖類、多酚類、脂溶性和萜類成分,還含有微量元素及其它化合物。

1.1 木脂素類

木脂素是由桂皮酸、桂皮醇、丙烯苯和烯丙苯單體組成的多為游離狀的雙分子苯丙素衍生物的植物雌激素。三白草中主要為木脂素類成分,至今已分離了一百多種[8]。主要包括三白草酮、三白草酮A、1′-表-三白草酮,三白草醇、三白草醇A、三白草醇B、三白草醇C、紅楠素D、4-甲氧基紅楠素D[8-9],SaurucinolI、里卡靈A、里卡靈B、5-甲氧基-里卡靈A、馬納薩亭A、馬納薩亭B、4-O-馬納薩亭B[10]、三白脂素(saucernetin)、三白脂素-8(saucernetin-8)、三白脂素-7(saucernetin-7)[11]、5,5′-二甲氧基-三白脂素、三白脂酮、三白脂酮 A、1′-表三白脂酮、nectandrin B、5,5′-dimethoxy-nectandrin B、3′,4′-methylenedioxy-3,4,5,5′-tetramethoxy-7,7′-epoxylignan、3′,4′-methylenedioxy-3,4,5-trimethoxy-7,7′-epoxylignan、machilin D[12]、蜥尾草亭A和B等[13]。

1.2 黃酮類

三白草包含黃酮類成分甚廣,主要為黃酮醇及其苷類。主要包括蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素[14-15]、山奈酚、木犀草素[16]、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-α-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖-7-O-α-D-葡萄糖苷[17]、rutin、蒙花苷、5,7-二羥基-3,4′-二甲氧基黃酮、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖(1→4)-α-L-鼠李糖苷等[18]。

1.3 揮發油類

三白草中廣泛存在揮發油類成分,陳宏降等[19]對三白草不同部位進行揮發性成分的研究,結果表明地上部分和根莖中均含有脂肪酸類和倍半萜類,主要有欖香烯、(-)-匙葉桉油烯醇(Spathulenol)和石竹烯等倍半萜類。尹震花等[20]對三白草不同部位揮發性成分進行比較,花、莖和葉中的共有成分有莰烯、β-月桂烯、檸檬烯、芳樟醇、順式氧化寧烯、香茅醛、順式檸檬醛、檸檬醛、α-蓽澄茄油烯、古巴烯、石竹烯、(Z)-b-金合歡烯、1-b-紅沒藥烯、1-去氫白菖烯、β-倍半水芹烯、γ-欖香烯、芳香族化合物枯茗醇和姜黃烯、脂肪族化合物4-(1,5-二甲基己基-4-烯)環己烯-2-酮和二十一烷。陳玉菡等[21]用HS-SPME和GC-MS對三白草葉片揮發性成分進行收集和測定,發現其主要成分為大根香葉D和、γ-欖香烯、β-欖香烯、反式-α-柑油烯和大根香葉烯B。

1.4 生物堿類

生物堿類也是三白草主要成分之一,Chen等[22]用MSPD-HPLC 從三白草中測定出N-對-反式-香豆酰胺、馬兜鈴內酰胺BII(AristolactamBⅡ、馬兜鈴內酰胺AII(AristolactamAⅡ)、天然馬兜鈴內酰胺(sauristolactam)四種內酰胺類生物堿。

1.5 其它化合物

三白草還含有許多其它化合物,如對羥基苯甲酸、鞣花酸、柯里拉京、沒食子酸[23]等鞣質類成分,藜蘆酸、對羥基苯甲酸、咖啡酸、原兒茶酸等酚酸類成分[16],還包括Fe、Cu、Zn、Mn、Mg、Cr等機體必需的微量元素[24],甘露醇等糖類等[8]。

2 藥理作用

現代藥理研究表明,三白草具有保肝、抑制中樞神經、抗炎、降血糖、抗腫瘤、抗氧化等作用,其中保肝、抗炎、降血糖、抗腫瘤和抗氧化與其清熱解毒、利水消腫功效相關。

2.1 保肝

徐春蕾等[25]用H2O2溶液損害人正常的LO2肝細胞,研究三白草木脂素類和黃酮類成分對受損細胞的保護作用,結果表明黃酮類成分槲皮素和異槲皮甙保護作用明顯,木脂素類無明顯作用。文獻表明,三白草酮衍生物保肝作用更佳,徐春蕾等[26]將三白草酮羰基還原得到其衍生物,保肝效果明顯增強。尹震花等[27]用四氯化碳注射致小鼠急性肝損傷后,取三白草提取物不同萃取部位進行給藥,測定結果表明石油醚部位和正丁醇部位對肝損傷所致血液中升高的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶有明顯降低效果。正丁醇部位分離出黃酮類成分,由此可初步說明三白草黃酮類如槲皮素和異槲皮甙成分具有保肝作用,應進行進一步研究。

2.2 抑制中樞神經

匡蕾等[7]用三白草95%乙醇提取物的氯仿部位和醋酸乙酯部位作用于尼古丁依賴小鼠,結果表明氯仿部位對小鼠依賴尼古丁癥狀抑制作用明顯,而醋酸乙酯部位作用不明顯。黃坤等[28]對三白草氯仿提取部位進行中樞神經抑制作用研究,用Irwin行為分級、斜板法、爬桿法對健康小鼠進行實驗,小鼠的自發活動和協調運動皆增強,證明三白草氯仿部位有中樞神經抑制作用。而氯仿提取部位主要含木脂素類成分[7],應進一步確定三白草抗尼古丁作用的具體成分和作用機制研究。

2.3 抗炎

邵克紅[29]將婦炎潔洗液與三白草洗劑作用于患者進行對比,結果表明三白草洗劑抗炎效果更佳。曾婉君等[30]進行三白草洗劑抗炎鎮痛藥理實驗研究,結果表明其對二甲苯所致小鼠耳腫脹和小鼠棉球肉芽腫有明顯的抗炎鎮痛藥效,而以三白草為君藥的三白草洗劑主要成分為黃酮類槲皮素及金絲桃甙[31]。陳宏降等[32]開展了三白草根莖95%乙醇提取物和地上部分95%乙醇提取物抗炎實驗,結果表明根莖的抗炎作用更明顯。Kim等[33]研究發現LPS(脂多糖)作用于Raw264.7細胞時,會加倍產生NO,而用三白草提取物作用于經LPS處理的Raw264.7細胞時,會以濃度依賴形式抑制NO的產生,達到抗炎作用。Jung等[34]發現三白草提取物中木脂素類可通過調控Nrf2/HO-1通路,產生抗炎作用。Xiao等[35]發現三白草提取物中木脂素類成分三白草酮通過Blimp-1途徑增加Th17細胞釋放IL-10緩解炎癥性腸炎(IBD)。Meng等[36]研究發現從三白草中提取的三白草酮可以通過促進HO-1的釋放抑制亞硝酸鹽和促炎介質的釋放,從而抑制LPS刺激RAW264.7細胞的炎癥反應。綜上,三白草黃酮類槲皮素及金絲桃甙和木脂素類Sauchinone為發揮抗炎作用的藥效物質基礎。

2.4 降血糖

四氧嘧啶型糖尿病與人類I型糖尿病相似,三白草活性成分廣泛,對糖尿病亦有治療作用[37]。葉蕻芝等[38]用三白草水提物作用于四氧嘧啶型糖尿病小鼠,發現其可通過減弱β細胞的損傷或者改善受損β細胞的功能,起到明顯的降血糖作用。后續研究發現三白草中多糖類和黃酮類成分對四氧嘧啶型糖尿病兔模型有降血糖作用,可提高兔體內的超氧化物歧化酶活性,降低丙二醇,使血糖降低[38-39]。邢冬杰等[40]研究三白草總黃酮類成分的降血糖作用,用高糖高脂飼料喂養聯合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法成功造模II型糖尿病小鼠,結果表明三白草總黃酮可降低FFA,改善體內氧化應激反應,從而達到降血糖的作用。綜上可知,三白草對I和II型糖尿病均有治療作用,但具體如何發揮作用并不清楚,后續研究可深入探索其發揮藥效的具體成分和作用機制。

2.5 抗腫瘤

轉錄因子Runx2參與乳腺細胞的生長發育和乳腺癌細胞體內的發展[41],呂紅等[42]用三白草95%乙醇提取物作用于乳腺癌細胞,結果證明其可抑制Runx2的轉錄,產生抗乳腺癌轉移的作用以達到抗腫瘤的目的。郭凌霄等[43]用三白草80%乙醇提取物作用于肝癌和肉瘤造模小鼠,進行體內外抑瘤試驗,結果顯示荷瘤小鼠體質量增加、生存期延長、胸腺和脾臟指數增加,抑瘤作用明顯。陳宏降等[44]用超臨界CO2萃取法萃取的三白草提取物作用于肝癌細胞7721/Adm耐藥株,其抑制癌細胞增值效果優于乙醇提取物。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是腫瘤細胞在體內發展的重要通路[45],吳冰等[46]研究發現三白草95%乙醇夾帶劑提取的三白草酮作用濃度與前列腺癌細胞成反比,與細胞周期中G1期細胞成正比,使cyclinD1蛋白表達減弱,并且抑制癌細胞遷移,對癌細胞產生細胞毒性,從而達到抗腫瘤作用。Kim等[47]研究發現三白草木脂素類三白草酮可誘導G0/G1期細胞周期阻滯和線粒體功能障礙,然后通過激活Huh-7細胞中的JNK/p38途徑引發細胞凋亡,三白草酮也誘導AMP活化蛋白激酶(AMPK)途徑的激活,抑制了哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其下游靶標的磷酸化,減弱了關鍵的促血管生成因子,包括缺氧誘導因子-1α、血管內皮生長因子和纖溶酶原激活物抑制劑-1,導致肝細胞癌(HCC)的細胞遷移和侵襲減少。EB病毒(EBV)是一種皰疹病毒,歸屬于癌病毒家族,可使靶細胞受感染呈現出惡性繁殖或形態變化的現象,從而引發鼻咽癌、淋巴癌等[48-49]。顧瓊等[50]證明馬納薩亭A、馬納薩亭B、三白草酮A、4-O-去甲基馬納薩亭B等可通過抑制EBV的裂解復制,達到抗鼻喉癌的作用。He等[51]研究發現從三白草中提取的三白草酮通過下調PI3K/Akt和Smad2/3信號通路抑制TGF-β1誘導的胃癌細胞遷移和侵襲。Zhen等[52]研究發現從三白草中提取的木脂素類成分Machilin D可以抑制乳腺癌小鼠中的乳腺癌細胞的生長和乳腺癌微球體的形成,并抑制NF-κB核轉位,及IL-6、IL-8的釋放,并誘導乳腺癌干細胞(CSC)死亡。綜上可知,三白草對多種腫瘤具有治療作用,納薩亭A、馬納薩亭B、三白草酮、Machilin D等木脂素類為治療腫瘤的有效成分,且超臨界CO2萃取法萃取的三白草提取物效果更佳,后續研究可繼續深入探索其他成分。

2.6 抗病毒

NF-κB活化才能使單純皰疹病毒復制,王春陽[53]和田蕾[54]等研究發現三白草水提物可抑制NF-KB通路的活化,從而抑制炎癥因子的產生,達到抗病毒的作用。三白草水提物中黃酮類成分蘆丁可通過抑制MEK1 ERK通路,在不同濃度下,可阻斷EV71誘導的細胞病變效應(CPE)和感染病毒粒子的產生,抑制EV71病毒的復制,從而產生抗病毒作用[55]。CVB3是一種與胰腺炎、心肌炎和I型糖尿病相關的病原體。Song等[56]研究發現馬納薩亭B可通過減少炎性細胞因子和趨化因子(包括TNF-α、IL-6、IFN-γ、CCL2和CXCL-1)的產生而減弱CVB3感染,并可增加線粒體ROS(mROS)水平,尚可增加Manass和IRF-3表達以及STING和TBK-1磷酸化,從而發揮抗病毒作用。綜上可知,三白草黃酮類成分和木脂素類可能是抗病毒起主要藥效的成分,并且可以考慮從抗炎的方向來研究抑制病毒的機制。

2.7 抗氧化

2.8 其他

謝暕等[60]用高脂飼料建造高脂血癥大鼠模型,并灌胃三白草總黃酮,結果證明三白草總黃酮可降低大鼠膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白表達,升高低密度脂蛋白、血管內皮舒縮因子表達,改善大鼠血流變指標和血管內皮功能,從而恢復機體脂質代謝。夏祥文[61]研究表明三白草酮可使心肌肥厚標志基因Nppa、Myh7表達降低,抑制了異丙腎上腺素激活的MAPK信號通路,降低通路相關JNK3基因表達,對心肌肥厚疾病有明顯的治愈力。Deng等[62]研究表明三白草酮可通過調節LKB1/AMPK和SHP-1/Syk途徑抑制FcεRI介導的肥大細胞活化和過敏反應,可能是治療過敏性炎性疾病的潛在治療劑。Yang等[63]研究發現三白草酮可通過調節高糖(HG)誘導的RPE細胞中的Akt/Nrf2/HO-1途徑預防HG誘導的氧化應激和細胞凋亡現象,從而治療糖尿病視網膜病變。

2.9 毒性成分研究

尹震花等[64]從三白草甲醇提取物石油醚萃取部位得到脂溶性成分,其中6-氨基-2,4-二甲苯酚含量最高,此化合物刺激性強,可能為三白草的毒性成分。徐春蕾等[25]研究木脂素類成分對受損肝細胞的保護作用時,發現里靈卡A和二氫愈創木酸在一定濃度下,對細胞有很大的殺傷力,可能為三白草的毒性成分。陳宏降等[65]取三白草不同部位95%乙醇提取物對小鼠進行灌胃,小鼠在一定時間開始出現死亡,解剖后發現肝臟有病變,結果表明三白草地上部位和根莖95%乙醇提取物均有毒性,主要為根莖。研究表明三白草95%乙醇提取物主要含木脂素類成分[66]。左月明等[67]研究發現,三白草95%乙醇提取物氯仿萃取部位出現小鼠死亡現象,研究表明氯仿部位為抗尼古丁戒斷的主要部位,且從中分離多數木脂素類成分,因此木脂素類成分是否含有毒性成分,還需進一步研究。尹震花等[68]研究表明,三白草中含有揮發油類成分欖香烯、肉豆蔻醚等毒性成分,但未進一步確定其是否為三白草的毒性活性成分。

3 Q-marker預測分析

為更有效的評價藥材的質量,劉昌孝提出了“Q-marker”的概念,以有效性、特有性、傳遞與溯源和可測性,綜合分析出藥材中可作為Q-marker的成分,充分體現成分的專屬性、差異性、配伍條件、以及與安全有效的關系[69-70]。三白草含成分類型多且復雜,不同產地、不同采收期、不同環境、不同加工、不同工藝等對三白草質量均有影響。因此,為建立三白草質量控制的方法,通過查閱總結文獻,預測其Q-marker。

3.1 基于植物親緣性及化學成分特有性證據的Q-marker預測

三白草科共有四屬六種,主產于我國中部以南地區的有裸蒴屬、蕺菜屬、三白草屬三屬,分別對應裸蒴和白苞裸蒴、魚腥草、三白草四種[71]。三白草屬中含有多種化學成分,木脂素類和黃酮類為其主要有效成分[1],目前從三白草中分離出的木脂素類有一百多種,三白草酮、里靈卡A、里靈卡B、馬納薩亭A、馬納薩亭B、三白脂素等為三白草特征性木脂素類成分[72]。木脂素類是以莽草酸途徑為核心單元的中間體次生代謝產物,兩分子的松柏醇(Coniferyl alcohol)經同化蛋白氧化酶(DIR)作用下生成二聚體松脂酚(Pluviatolid),再經過自由基氧化反應產生不同的木脂素類成分[73]。具體途徑如圖1。

圖1 木脂素類化合物生物合成途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of lignans

3.2 基于化學成分與有效性相關證據的Q-marker預測分析

3.2.1 成分與傳統功效相關 三白草傳統功效為利水消腫,清熱解毒,現代藥理學研究表明,三白草保肝、抗炎、降血糖、抗腫瘤和抗氧化等作用與傳統功效相關。三白草洗液中君藥三白草黃酮類成分槲皮素及金絲桃甙,對濕熱所致帶下病(如陰道炎等)有很好的療效[31],可抑制巴豆油所致的小鼠耳部炎癥,對大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌產生抗菌作用[74]。三白脂素-8對急性炎癥和棉球肉芽腫有抗炎活性[75];總木脂素具有抗肝纖維作用;三白草酮具保肝、抗心血管疾病、抗腫瘤作用[44];三白草總黃酮具降血糖、抗氧化作用;異槲皮素、槲皮苷具保肝作用。故以上總結的木脂素類成分三白草酮、三白脂素-8,以及黃酮類成分槲皮素、金絲桃甙異、槲皮素、槲皮苷可作為Q-marker的首選成分。

3.2.2 成分與新的藥效相關 三白草具有中樞神經抑制作用,主要表現在抗尼古丁戒斷。藥效研究表明,三白草提取物氯仿萃取部位對尼古丁依賴小鼠有明顯的減緩戒斷癥狀的作用,氯仿部位主要含木脂素類成分。三白草酮對異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌細胞肥大或者凋亡有抑制作用,并可抑制肥大細胞活化和過敏反應。總黃酮可改善大鼠高脂血癥,調節機體脂質代謝。故以上總結的木脂素類成分三白草酮和黃酮類成分可被推測為Q-marker成分。

3.2.3 成分與傳統藥性相關 中藥基礎理論的核心內容是四性、五味,能指導中醫臨床遣藥組方,可用于確定Q-marker。三白草味甘、辛,性寒。現代仿生技術電子舌(electronic tongue)可模擬人體味覺器官分析,并且識別“味道”,評價出相應的化學成分[76]。藥效物質基礎研究表明,甘味藥主要化學成分為多糖類、苷類,識別甘味味覺細胞表面受體為由T1R1、T1R2、T1R3受體組成的G蛋白偶然聯受體[77]。TRPs家族主要包括TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8等受體,辛味藥主要通過TRPV1受體發揮辛味藥性[78],其主要化學成分為揮發油類、萜類和生物堿類[79]。故三白草的黃酮苷類、多糖類和揮發油類可被推測為Q-marker成分。

3.3 基于可入血成分的Q-marker預測分析

李青倩[80]采用HPLC-UV建立原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、木犀草素和三白草酮含量的測定方法,亦對口服三白草浸膏的大鼠進行眼眶取血,研究藥代動力學規律,7種成分均在血漿中被檢測,數據顯示各成分在體內吸收快。故原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、木犀草素和三白草酮成分可作為基于可入血成分篩選的Q-marker成分。

3.4 基于化學成分可測性相關證據的Q-marker預測分析

化學成分可測性在建立中藥質量評價方法中必不可少,需滿足可定性定量才符合專屬性要求。黃莉等[81]采用紫外分光光度計建立了三白草木脂素含量測定的方法,發現不同產地三白草木脂素含量的差異。李小玲等[82]采用波長切換結合梯度洗脫可同時測定三白草肝炎糖漿中木脂素類三白草酮和里靈卡A含量。何卓儒等[13]應用HPLC可同時測定木脂素類成分manassantin A和manassantin B含量,并建立了其含量測定的方法。毛細管區帶電泳法可測三白草中黃酮類成分蘆丁和槲皮素的含量[83]。超高效液相色譜串聯質譜法可同時測定原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、木犀草素、三白草酮的含量[80]。根據所述,以上原兒茶酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、木犀草素、三白草酮等木脂素和黃酮類成分可作為Q-marker的首要選擇對象。

4 總結

三白草為民間常用中藥,化學成分繁雜,活性顯著且廣泛,具多種藥理作用,藥用價值開發前景廣闊。隨著時代的進步,疾病越來越復雜,且臨床實踐研究較難進行。對于含有復雜成分的中藥,應該進一步深入研究其針對不同病癥的作用機制及臨床應用的靈活性,建立更加全面的三白草質量標準,嚴格把控藥物研究全過程,讓結果更加具說服力和準確性。本文從化學成分和藥理作用研究現狀入手,從親緣性及特有性、傳統藥效、新的藥效、傳統藥性、入血成分、可測性,初步分析三白草Q-marker,為三白草質量標準研究提供可行的思路。

根據前文總結可知,三白草具有一定的毒性,毒性成分可能是木脂素類,而前人多數研究證明,三白草木脂素類為主要有效成分之一,并具保肝、中樞神經抑制、降血糖、抗腫瘤等多種藥理作用。因此,對于毒性成分的深入研究,以及三白草用藥的安全劑量等研究、對臨床用藥安全具重要意義。