大蒜素對脂多糖誘導腹腔巨噬細胞炎癥反應的抑制作用及機制

李鴻洋,李敬雙,高泉頎,于 洋,*

(1.錦州醫科大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫科大學畜牧獸醫學院,遼寧錦州 121000)

炎癥是機體對各種致炎因子所產生的防御反應。炎癥表現為對機體的保護作用,但過度和持續的炎癥反應會對機體造成傷害。隨著近年來對天然抗炎藥物的深入研究,越來越多天然藥物的抗炎作用獲得認可。探索具有抗炎活性的天然產物以改善或治愈炎癥已成為當前研究的熱點之一。

大蒜(AlliumsativumL.)為百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium),二年生草本植物。大蒜營養豐富,嫩苗、花莖和鱗莖均可食用,用途廣泛,加工產品種類多樣,在國際貿易市場上占有重要地位,也是我國重要的出口創匯蔬菜[1]。大蒜素是大蒜中含硫有機化合物的主要有效成分,化學名為二烯丙基三硫化物,其分子式為C6H9S3[2]。研究表明,大蒜素具有多種藥理學作用,例如抗癌[3]、抗炎[4]、抗菌[5]、抗氧化作用等[6]。

Wang等[7]研究結果表明,大蒜素通過PI3K/AKT途徑改善氧化應激、炎癥和凋亡,從而減輕LPS誘導的新生大鼠急性肺損傷(ALI)。大蒜素可用于開發治療ALI的新藥。Zhang等[8]通過大蒜素對脂多糖(LPS)誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)血管氧化應激和炎癥的影響及作用機制,發現大蒜素能夠減弱LPS誘導的血管炎癥反應。任亮等[9]通過大蒜素對模型小鼠抗炎作用的研究,發現大蒜素具有一定的抗炎作用。姜云傳[10]通過大蒜素抑制小膠質細胞抗炎作用的研究,發現大蒜素可能通過抑制小膠質細胞活化和釋放細胞因子白介素1β(IL-1β)等來發揮抗炎作用。已有研究表明,大蒜素具有抗炎作用,但有關大蒜素抗炎作用機制尚不明確,需要進一步探討研究。

為進一步明確大蒜素的抗炎作用及其機制,本研究以LPS刺激小鼠原代腹腔巨噬細胞為體外炎癥模型,在基因和蛋白水平上觀察大蒜素對腹腔巨噬細胞吞噬炎癥因子COX-2、NO、IL-6的影響,并以地塞米松作為陽性對照,探討其抗炎的活性及作用機制,以期為大蒜素在臨床抗炎藥效的開發和利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康SPF級雄性Balb/c小鼠 體重(25±3) g,6～8周齡,購于錦州醫科大學生命科學研究院,生產許可證號SCXK(遼)2014-0004;大蒜素 批號:J25J9S64201,純度:UV≥98%,上海源葉生物科技有限公司;新生牛血清 浙江天杭生物科技有限公司;脂多糖(LPS)、甲基咪唑藍(MTT)、臺盼藍、中性紅、RPMI-1640培養基、二甲基亞砜(DMSO)、COX-2、IL-6、NO檢測試劑盒 北京索萊寶科技有限公司;地塞米松 上海聯碩生物科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ、引物 大連寶生物科技有限公司;Trizol(R0016)、BCA蛋白定量試劑盒 碧云天生物技術有限公司;COX-2、IL-6、iNOS抗體 萬類生物科技有限公司;NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65 Cell Signaling Technology(CST)公司;β-actin抗體 武漢博士德生物工程有限公司。

CKX41S型倒置顯微鏡 日本 Olympus公司;HBS-1096A型酶標儀 南京德鐵實驗設備有限公司;Mastercyler ep realplex4型實時熒光定量PCR儀、AG 22331 Hamburg型PCR擴增儀 德國Eppendorf公司;Amersham Imager 600全自動成像分析系統 GE。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離與培養 小鼠飼養于環境溫度(20±2) ℃,濕度50%±10%,按照12 h光照/12 h黑暗,自由攝食、飲水的飼養條件喂養,實驗前適應性飼養1周。頸椎脫臼法處死小鼠,75%乙醇浸泡3 min,將5 mL預冷的PBS注入腹腔,輕按摩腹部約2 min,靜置5 min,抽取腹腔液,于2000 r/min、4 ℃離心5 min,棄上清。將細胞沉淀在紅細胞裂解液中稀釋(4 mL/小鼠),在室溫下孵育5 min,然后于2000 r/min、4 ℃離心5 min,棄上清。將細胞沉淀懸浮于RPMI-1640完全培養基,計數,調整細胞至所需濃度。于37 ℃ 5% CO2培養箱孵育18 h至完全貼壁,吸棄上清,去掉未貼壁細胞,加入新鮮的RPMI 1640完全培養基,即得到純化的腹腔巨噬細胞[11]。

1.2.2 實驗分組及處理 實驗分為正常對照組、LPS組、LPS+地塞米松組、LPS+不同濃度的大蒜素處理組,每組均設5復孔。正常對照組:不做任何處理,正常培養24 h;LPS組:每孔加入終濃度為1 μg/mL的LPS;LPS+地塞米松組:每孔先加入終濃度為100 μg/mL的地塞米松對細胞預處理2.5 h,再加入終濃度為1 μg/mL的LPS刺激細胞;LPS+不同濃度的大蒜素處理組:每孔先加入不同濃度(40、80、160 μg/mL)的大蒜素對細胞預處理2.5 h,再加入終濃度為1 μg/mL的LPS刺激細胞。

1.2.3 細胞活力測定 參考Liu等[12]實驗方法,采用MTT比色法測定細胞活力。細胞按5×103cell/mL接種于96孔板,按照1.2.2實驗分組及處理,37 ℃ 5% CO2培養24 h。除去培養基后,每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL,避光孵育4 h,吸棄培養基,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min使紫色沉淀充分溶解,酶標儀于570 nm波長處測定吸光度值。

細胞活力(%)=(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100

1.2.4 中性紅吞噬實驗法檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能 參考甄慶潔等[13]實驗方法,細胞按1×105cell/mL接種于96孔板,37 ℃ 5% CO2培養18 h,按照1.2.2實驗分組及處理,培養24 h,棄上清,加100 μL的中性紅溶液(生理鹽水溶解,1 g/L),孵育30 min后,用預冷的PBS清洗3次,每孔加入細胞裂解液100 μL,4 ℃裂解12 h,酶標儀于570 nm波長處測定吸光度值。

1.2.5 Griess法檢測NO的含量 參考杭宜嶺等[14]實驗方法,細胞按2×106cell/mL接種于24孔板,37 ℃ 5% CO2培養18 h,按照1.2.2實驗分組及處理,培養24 h,于4 ℃ 3000 r/min離心20 min,收集細胞上清液,每組均設5個復孔,按照NO檢測試劑盒,酶標儀于450 nm處測定細胞上清液中NO的含量。

1.2.6 ELISA法檢測炎癥因子COX-2酶活性和IL-6的含量 參考Lee等[15]實驗方法,細胞按2×106cell/mL接種于24孔板,37 ℃ 5% CO2培養18 h,按照1.2.2實驗分組及處理,培養24 h,于4 ℃ 3000 r/min離心10 min,收集細胞上清液,每組均設5復孔,按照ELISA檢測試劑盒操作,酶標儀于450 nm處測定OD值并計算炎癥因子COX-2酶活性和IL-6的含量。

1.2.7 Real-time PCR法檢測基因COX-2、iNOS和IL-6 mRNA表達 參考Pan等[16]實驗方法,細胞按1×106cell/mL接種于12孔板,37 ℃ 5% CO2培養18 h;按照1.2.2實驗分組及處理,培養24 h,棄上清,用預冷的PBS清洗2次,采用Trizol法提取細胞總RNA。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit 試劑盒進行操作,將1 μg的總RNA反轉錄成CDNA。根據 NCBI數據庫查詢得到相關基因序列,采用Primer 6引物設計軟件設計引物如表1。

表1 小鼠COX-2、iNOS、IL-6和內參ACTB引物序列Table 1 COX-2,iNOS,and IL-6 of mouse and internal reference ACTB primer sequences in the experiment

按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒的說明配制反應體系:2×TB Green Premix Ex Taq II 12.5 μL,特異性引物F和R(終濃度為0.4 μmol/L)各1 μL,cDNA 2 μL,滅菌水8.5 μL,共25 μL,混合均勻,進行Real time PCR反應,按照擴增試劑盒的程序設置為預變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s退火,40個循環。以β-肌動蛋白(ACTB)作為內參,采用 2-ΔΔCt方法進行數據分析。

1.2.8 Western Blot法檢測COX-2、iNOS和IL-6及P65的總體及磷酸化水平 參考Oh等[17]實驗方法,細胞按2×108cell/mL接種于6孔板,37 ℃ 5% CO2培養18 h;按照1.2.2實驗分組及處理,培養24 h,棄上清。用預冷的PBS洗滌細胞,然后在冰上用RIPA強裂解緩沖液提取總蛋白,并用BCA法進行蛋白定量,煮沸備用。用10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,并在300 mA 60 min條件下轉至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h,并用TBST洗滌5 min,4 ℃條件下一抗(COX-2、iNOS、IL-6、p-p65、p65和β-actin)孵育過夜,并用TBST洗滌3次后室溫下辣根過氧化物酶標記過的羊抗兔孵育1 h。TBST洗膜3次,ECL發光顯影液曝光膠片,曝光成像后,運用Image J軟件進行灰度分析。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 大蒜素對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響

由圖1可知,MTT法檢測結果顯示,大蒜素在40、80、160 μg/mL三個濃度劑量下,單獨作用或與1 μg/mL LPS共同處理24 h后均未對小鼠腹腔巨噬細胞生長造成顯著影響(P>0.05)。因此,在后續實驗中采用1 μg/mL LPS作為刺激濃度,并選取40～160 μg/mL濃度范圍作為大蒜素的處理濃度。

圖1 大蒜素對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響Fig.1 Effect of allicin on the cell viability of mouse peritoneal macrophages

2.2 大蒜素對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的影響

由圖2可知,通過中性紅吞噬實驗法,檢測大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響,當1 μg/mL LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞時,與正常對照組比較,LPS組巨噬細胞吞噬中性紅的能力極顯著增加(P<0.01),表明LPS能增加巨噬細胞吞噬功能。與LPS組比較,大蒜素處理組和地塞米松組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅的能力增加,其中大蒜素(40 μg/mL)處理組與LPS組之間比較差異不顯著(P>0.05),其他各處理組均極顯著高于LPS組(P<0.01),且呈良好的劑量-效應關系,表明大蒜素能有效的激活小鼠腹腔巨噬細胞,從而增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力。

圖2 大蒜素對小鼠腹腔巨噬細胞中性紅吞噬能力的影響Fig.2 The effect of allicin on neutral red phagocytic capacity of mouse peritoneal macrophages注:與正常對照組比較,##表示差異極顯著P<0.01;與LPS組比較,*表示差異顯著P<0.05,**表示差異極顯著P<0.01;圖2～圖8、圖10～圖12同。

2.3 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞產生COX-2酶活性、NO和IL-6分泌的影響

在體外細胞炎癥模型制作中,LPS是最主要、作用最強的促炎手段[18]。在炎性因素影響下COX-2及其產物前列腺素E2(PGE2)可被迅速誘導合成,促進炎癥反應的發生和發展[18]。一氧化氮(NO)是介導炎癥反應的關鍵因子,在炎癥的各個階段均有產生[19]。小鼠腹腔巨噬細胞在LPS的誘導下釋放大量的促炎因子,如IL-6的累積會加劇炎癥反應進程。

由圖3～圖5可知,當用1 μg/mL的LPS刺激細胞時,與正常對照組比較,LPS組的COX-2酶活性、NO和IL-6分泌極顯著增加(P<0.01),說明LPS刺激腹腔巨噬細胞造模成功。與LPS組比較,地塞米松處理組小鼠腹腔巨噬細胞COX-2酶活性與NO和IL-6的分泌極顯著降低(P<0.01);大蒜素40 μg/mL濃度組與LPS組比較COX-2酶活性、NO和IL-6分泌顯著降低(P<0.05),其他各處理組與LPS組比較均極顯著降低(P<0.01),且在大蒜素濃度為160 μg/mL時,NO和COX-2的抑制活性高于地塞米松組,但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中COX-2酶活性的影響Fig.3 Effect of allicin on COX-2 enzyme activity of LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖4 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中NO分泌的影響Fig.4 Effect of allicin on NO secretion of LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖5 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中IL-6分泌的影響Fig.5 The effect of allicin on IL-6 secretion of LPS-induced mouse peritoneal macrophages

2.4 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞COX-2、iNOS和IL-6 mRNA表達的影響

在病理狀態下,NO可以通過NO/cGMP路徑上調COX-2的表達,NO由誘導型一氧化氮合酶(iNOS)經一系列氧化還原反應生成,在由LPS誘導的巨噬細胞炎癥中,誘導型iNOS表達增高由iNOS衍生的過量NO誘導的硝化應激會引起過度炎癥反應,加重炎癥的發生[20]。同時,COX-2也促進iNOS的表達,共同參與炎癥的發生、發展[21]。IL-6原被確定為B細胞生長因子[22],IL-6在急性炎癥反應中的作用主要表現為對多種細胞的促炎作用和誘導肝組織產生急性反應蛋白。

由圖6、圖8可知,小鼠腹腔巨噬細胞經LPS刺激后,與正常對照組比較,LPS能極顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞COX-2和IL-6 mRNA的表達(P<0.01)。與LPS組比較,大蒜素(40 μg/mL)處理組小鼠腹腔巨噬細胞COX-2和IL-6 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05),其他各處理組COX-2和IL-6 mRNA表達水平均極顯著降低(P<0.01),且大蒜素濃度為160 μg/mL組對IL-6 mRNA轉錄抑制作用高于地塞米松組,但差異不顯著(P>0.05)。由圖7可知,LPS能極顯著提高iNOS mRNA表達(P<0.01),大蒜素和地塞米松處理后均能極顯著降低LPS誘導的iNOS mRNA 表達(P<0.01)。結果表明,大蒜素在LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞中可以發揮保護和抑制作用。

圖6 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中COX-2 mRNA表達水平的影響Fig.6 Effect of allicin on the mRNA expression level of COX-2 in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖7 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中iNOS mRNA表達水平的影響Fig.7 Effect of allicin on the mRNA expression level of iNOS in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖8 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中IL-6 mRNA表達水平的影響Fig.8 Effect of allicin on the mRNA expression level of IL-6 in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

2.5 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞COX-2、iNOS和IL-6蛋白表達以及NF-κB p65磷酸化的影響

NF-κB是LPS刺激的反應中至關重要的下游信號途徑,與腫瘤的生長和炎癥有關[23]。NF-κB是真核細胞中的典型轉錄因子,參與炎癥、免疫反應和抗凋亡機制,炎癥細胞因子的產生受NF-κB信號通路的調節,LPS能誘導NF-κB信號通路的激活[24]。當NF-κB被激活時,活性的P65被轉運到細胞核中以結合到促炎基因,這可以觸發在LPS誘導的巨噬細胞的炎癥反應,如促炎性酶如COX-2、iNOS及促炎細胞因子IL-6。

由圖10可知,與正常對照組比較,LPS組小鼠腹腔巨噬細胞COX-2蛋白表達極顯著增加(P<0.01),表明LPS刺激巨噬細胞造模成功。與LPS組比較,大蒜素處理組和地塞米松組小鼠腹腔巨噬細胞COX-2蛋白表達均顯著降低,并隨著大蒜素濃度的增加,COX-2蛋白表達逐漸降低,其中大蒜素(40 μg/mL)處理組與LPS組比較差距顯著(P<0.05),其他各處理組及地塞米松組均極顯著低于LPS組(P<0.01)。由圖11～圖13可知,LPS組小鼠腹腔巨噬細胞iNOS和IL-6的蛋白表達以及NF-κB p65磷酸化程度均極顯著增加(P<0.01)。大蒜素各處理組與地塞米松組小鼠腹腔巨噬細胞iNOS和IL-6的蛋白表達以及NF-κB p65磷酸化程度均極顯著降低(P<0.01),且都呈濃度依賴性。結果表明,大蒜素和地塞米松均能夠顯著抑制炎癥因子COX-2、iNOS和IL-6的蛋白表達,也能顯著抑制NF-κB p65發生磷酸化作用,抑制NF-κB信號通路的激活。

圖9 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中COX-2、iNOS、IL-6、P-P65和P65影響的蛋白表達電泳圖Fig.9 Electrophoresis of allicin on the protein expression COX-2,iNOS,IL-6,P-P65 and P65 in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖10 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中COX-2蛋白表達的影響Fig.10 Effect of allicin on the protein expression COX-2 in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖11 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中iNOS蛋白表達的影響Fig.11 Effect of allicin on the protein expression iNOS in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖12 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中IL-6蛋白表達的影響Fig.12 Effect of allicin on the protein expression IL-6 in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

圖13 大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞中NF-κB p65磷酸化的影響Fig.13 Effect of allicin on NF-κB p65 Phosphorylation in LPS-induced mouse peritoneal macrophages

3 結論

本研究結果發現,大蒜素作用于小鼠腹腔巨噬細胞后,細胞生長狀態良好,在一定劑量范圍內,MTT測定證實其無細胞毒性;中性紅吞噬實驗表明大蒜素能提高巨噬細胞的吞噬能力;通過檢測大蒜素作用后小鼠腹腔巨噬細胞的COX-2酶活性與NO和IL-6分泌降低,證實大蒜素具有抑制COX-2酶活性與NO和IL-6分泌的作用。同時大蒜素還能顯著抑制小鼠腹腔巨噬細胞COX-2、iNOS和IL-6 mRNA和蛋白的相對表達,顯著抑制NF-κB p65信號通路的磷酸化。表明大蒜素對LPS誘導的小鼠腹腔巨噬細胞的抗炎作用可能是通過抑制NF-κB信號通路激活途徑來實現的。因此,本研究結果初步表明,大蒜素可能是治療與巨噬細胞過度活化有關的各種炎性疾病的潛在藥物。