響應面優化羥丙基-β-環糊精對血根堿的包合工藝

梁 浩,錢璽丞,杜曉靜,郁建生

(銅仁職業技術學院中獸藥重點開放實驗室,貴州銅仁 554300)

血根堿(sanguinarine)是一種苯并菲啶型生物堿,主要存在于白屈菜和博落回的全草、紫堇的根、塊之中以及血水草的地上部分[1-7]。研究表明其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、改善肝功能等多種藥理活性[8-11],廣泛應用于生物醫藥、獸藥和飼料添加劑以及生物農藥之中[12-17],且血根堿可有效清除自由基保護生物大分子的氧化和羰基化損傷,具有作為天然食品抗氧化劑的潛力[18]。但因其自身理化性質的缺陷,如穩定性較差和水溶性低等因素限制了其在臨床上的應用范圍[19]。

環糊精包合技術具有提高難溶性藥物溶解度增加其穩定性等優點[20],羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)是β-環糊精的羥丙基衍生物,與其母體β-環糊精相比,水溶性更好,在人體中耐受性好,無腎毒性,是一種適用性較廣的低毒、安全、有效的藥物增溶劑,目前其正在逐步代替其母體,廣泛應用于食品和醫藥等多個領域[21]。

目前關于羥丙基-β-環糊精對苯并菲啶型生物堿的包合作用研究較少,主要集中在對小檗堿的包合作用及包合物性質的研究,對血根堿的包合作用尚未有人報道[22-24]。因此,本試驗以羥丙基-β-環糊精為包合材料,將血根堿制成羥丙基-β-環糊精包合物,并通過響應面法優化血根堿包合物的制備工藝,以期增加血根堿的溶解度和穩定性,為進一步拓寬血根堿的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血根堿 參考文獻[25]自制,經HPLC檢測純度為95.1%;血根堿標品(HPLC≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;羥丙基-β-環糊精(純度99%) 上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸等 均為分析純,購自國藥試劑。

Agilent1290超高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;T10CS紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;CP323C千分之一分析天平 奧豪斯儀器有限公司;CPA225D十萬分之一分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司;DF-101S數顯恒溫集熱式磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;FZG-1真空干燥箱 南京華莎干燥設備有限公司;DHG-9030A鼓風干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司;SG5200HE超聲波清洗機 上海冠特超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物制備 稱取一定量的羥丙基-β-環糊精加入5 mL蒸餾水中,在一定溫度下水浴加熱,加入血根堿0.1 g,避光水浴攪拌一定時間,之后于40 ℃真空干燥,即得包合物。

1.2.2 血根堿-羥丙基-β-環糊精包合單因素試驗

1.2.2.1 羥丙基-β-環糊精與血根堿配比對包合率的影響 在包合時間1 h,包合溫度60 ℃的條件下,研究羥丙基-β-環糊精與血根堿不同包合比(1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 g∶g)對血根堿包合率的影響。

1.2.2.2 包合溫度對血根堿與羥丙基-β-環糊精包合的影響 在包合比10∶1,包合時間1 h的條件下,研究不同包合溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對血根堿包合率的影響。

1.2.2.3 包合時間對血根堿與羥丙基-β-環糊精包合的影響 在包合比10∶1,包合溫度60 ℃的條件下,研究不同包合時間(1、2、3、4、5、6 h)對血根堿包合率的影響。

1.2.3 血根堿與羥丙基-β-環糊精包合試驗的響應面分析 以血根堿包合率(Y)為評價指標,在單因素試驗基礎上,選取血根堿與羥丙基-β-環糊精配比(X1)、包合溫度(X2)和包合時間(X3)3個因素,進行3因素3水平的響應面(RSM)設計,實驗設計中的水平及編碼值見表1。

表1 響應面試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.4 血根堿含量測定

1.2.4.1 標準曲線繪制 精密稱取10.65 mg血根堿對照品置于100 mL容量瓶,用甲醇-1.0%鹽酸溶液(50∶50)溶解,并稀釋定容,得血根堿標準溶液。精密移取血根堿標準溶液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL于50 mL容量瓶中,加甲醇-1.0%鹽酸溶液(50∶50)定容,進行色譜檢測。以峰面積Y為縱坐標,濃度X為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:Y=-3.6454+13.9661X,R2=0.99994,在 0～42.6 μg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.4.2 色譜條件 檢測波長 271 nm;C18色譜柱;進樣量 2 μL;流速 0.5 mL/min;0.1%磷酸-乙腈作為流動相;柱溫 25 ℃。

1.2.4.3 樣品測定及包合率計算 按單因素試驗方案和響應面設計方案制備血根堿羥丙基-β-環糊精包合物,稱量包合物約10 mg,精密稱定,置于25 mL容量瓶中,加1.0%鹽酸-甲醇溶液(50∶50)超聲溶解,稀釋定容,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,制得供試樣品溶液。在波長為271 nm條件下采用高效液相色譜法測定,代入標準曲線回歸方程計算得到血根堿含量。血根堿包合率(%)=(加入血根堿總質量-包合物中游離血根堿質量)/加入血根堿總質量×100

1.2.5 血根堿包合物的驗證 分別配制相同濃度(6 μg/mL)的血根堿溶液、血根堿與羥丙基-β-環糊精混合物溶液、血根堿與羥丙基-β-環糊精包合物溶液、羥丙基-β-環糊精溶液,分別掃描在200～400 nm之間的紫外光譜圖。

1.3 數據處理

單因素試驗重復測定3次結果采用Origin Pro 8.0 軟件進行處理,采用Design-Expert 8.0.6.1對響應面試驗結果進行數據統計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 羥丙基-β-環糊精與血根堿配比對包合率的影響 通過包合比對包合率影響的試驗數據顯著性分析得P=0.0049達到極顯著水平(P<0.01),由圖1可知,隨著羥丙基-β-環糊精與血根堿包合比的增大包合率隨之增大,但到10∶1時血根堿的包合率達到46.5%,之后血根堿包合率隨包合比的繼續增大,包合率增大不明顯,其原因是包合比較小時羥丙基-β-環糊精過少,不足以包合所有的血根堿,當達到10∶1時,羥丙基-β-環糊精對血根堿的包合以達到飽和,因此繼續增加羥丙基-β-環糊精的用量包合率增大不明顯,從經濟方面考慮,選擇羥丙基-β-環糊精與血根堿配比為10∶1。

圖1 包合比對包合率的影響Fig.1 Effect of inclusion ratio on inclusion rate

2.1.2 包合溫度對血根堿包合率的影響 通過包合溫度對包合率影響的試驗數據顯著性分析得P=0.0059達到極顯著水平(P<0.01),由圖2可知,隨溫度的上升包合率不斷增大,當上升到60 ℃時,包合率達到最大值為46.5%,之后隨溫度的繼續升高包合率開始下降,可能是由于包合過程是一個動態平衡過程,溫度較低分子運動緩慢不利于客體分子進入主體分子,溫度過高由于分子運動加劇,導致包合物分解[26]。因此選擇60 ℃為較佳溫度。

圖2 包合溫度對包合率的影響Fig.2 Effect of inclusion temperature on inclusion rate

2.1.3 包合時間對血根堿包合率的影響 通過包合時間對包合率影響的試驗數據顯著性分析得P=2.22×10-5達到極顯著水平(P<0.01),由圖3可知,隨著包合時間的增加,血根堿包合率增大,當包合時間3 h時血根堿包合率達到最大值為73.20%,縮短或延長包合時間血根堿包合率均會下降,可能是由于包合過程是客體分子進入主體分子并形成氫鍵的動態過程,時間縮短包合過程尚未完成,時間延長會導致已經包合的包合物脫離包合[26]。因此選擇3 h為較佳包合時間。

圖3 包合時間對包合率的影響Fig.3 Effect of inclusion time on inclusion rate

2.2 響應面試驗結果

表2 試驗設計方案及試驗結果Table 2 Experimental design and results

從表3 可知,血根堿工藝參數回歸模型的P值=0.0005達到極顯著水平(P<0.01),且失擬項P值=0.2030(P>0.05),不顯著,方程決定系數R2=0.9584,說明回歸方程的擬合度較好,預測值和實測值之間具有高度的相關性,可用于血根堿包合反應的分析與預測。回歸方程各項方差分析表明,3個影響因素對血根堿與羥丙基-β-環糊精包合影響的大小順序依次為:包合時間(X3)>包合比(X1)>包合溫度(X2)。

表3 Box-Behnken實驗方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 包合工藝的響應面分析與優化 圖4為包合工藝的各因素兩兩交互作用對血根堿包合反應影響的3D響應曲面圖。由圖4可看出,包合溫度與包合時間的兩因素交互作用不顯著,包合比與包合溫度、包合比與包合時間的兩因素交互作用顯著。根據響應面分析得到的較佳工藝參數:包合比10.26∶1,包合溫度為60.16 ℃,包合時間為3.15 h。在此條件下,血根堿與羥丙基-β-環糊精包合率的理論預測值為72.43%。

圖4 兩因素交互作用對包合率的影響Fig.4 Each two factors interact on the inclusion rate of response surface map

2.2.3 工藝驗證試驗 考慮到實際操作的局限性,故將實際提取工藝條件修正為包合比10∶1,包合溫度為60 ℃,包合時間為190 min,在修正條件下進行3 次重復驗證試驗,血根堿包合率平均值達到73.55%,與理論值相對誤差為1.5%。由此可見,響應面分析的優化結果與實際值較吻合,說明采用Box-Behnken組合設計優化得到的血血根堿與羥丙基-β-環糊精包合工藝參數準確可靠。

2.3 血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物的驗證

利用紫外光譜法[27]對血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物的形成進行驗證,結果如圖5所示。

圖5 血根堿、羥丙基-β-環糊精、兩者混合物及其包合物的紫外光譜Fig.5 Ultraviolet spectrum of sanguinarine,β-cyclodextrin,mixtures of the two and their inclusions

不同物質的紫外吸收曲線以及吸收曲線波峰和波谷的位置均有差異,如圖5所示,從圖中可以看到,血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物的紫外吸收曲線波峰位于324 nm以及269.5 nm,血根堿和血根堿-羥丙基-β-環糊精混合物的波峰位于329 nm和275 nm,因此可判定得到的物質并不是血根堿與羥丙基-β-環糊精的簡單混合物,而是血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物。

3 結論

本研究采用溶液攪拌法制備血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物,并通過響應面法對包合工藝進行了優化,結果表明血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物最佳制備工藝為:羥丙基-β-環糊精和血根堿配比為10∶1,包合溫度為60 ℃,包合時間為190 min,包合率達到73.55%。經紫外光譜驗證,血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物已經形成,本實驗通過響應面法優化出的血根堿-羥丙基-β-環糊精包合物的最佳制備工藝穩定、可靠,為血根堿新制劑的研究開發提供了理論依據。