高產維生素K2菌株的選育及發酵條件優化

杜亞飛,包瑞敏,包智影,張 智,*

(東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

維生素K主要有兩種,分別為VK1(Phylloquinone,葉綠醌)和VK2(Menaquinone,甲萘醌類),VK1主要由植物產生,VK2主要由微生物產生[1]。維生素K1和維生素K3都要在肝臟內轉換成VK2才能和腸道微生物合成的VK2一起發揮功能。VK2在食品中含量極少,有“鈾金維生素”之稱,可以預防和治療骨質疏松[2-3],它是一類具有相同2-甲基-1,4-萘醌環不同長度側鏈的系列衍生物[4],由于異戊二烯側鏈在C-3上的長度不同,VK2可以分為14種,分別以MK-n表示(其中n表示側鏈異戊二烯單位數)。然而MK產量較高的菌種為數不多,能進行發酵生產MK的菌種主要是產MK-4革蘭氏陰性菌的產黃桿菌(FlauobacteriumSP.),以及產MK-7的革蘭氏陽性菌的枯草桿菌(Bacillussubtilis),本文中所用菌種為產MK-7的納豆菌。MK-7較MK-4半衰期長且功能廣泛,活性強大,作用持久[5]。日本關東地區居民的血液中 MK-7 含量與關西地區的相比要高得多,所以關東地區居民的股頸骨折發病率比關西居民低很多[6]。MK-7是哺乳動物產生凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ以及X的一個非常重要的輔因子,是正常血液凝固時不可或缺的營養素[7-8]。MK-7還能夠活化鈣化抑制基質Gla蛋白質(matrix Gla protein MGP),從而預防鈣質在血管中沉淀,最終形成動脈硬化[9-10]。另外,MK-7 能夠將骨髓中的骨鈣素活化,從而促進骨頭的形成[11-12]。最近的流行病學研究表明,納豆中的MK-7能夠顯著提高老年人骨頭中的礦物質密度(BMD),降低老年人的髖骨骨折風險[13]。

維生素K被廣泛用于醫藥工業上。對微生物法生產VK2的研究主要體現在菌種的誘變和發酵條件的優化上[8],但大部分對于納豆菌誘變的研究都只停留在菌種誘變方面[14-16],并沒有對營養型缺陷菌株進行過研究。Yoshinori等[17]利用紫外(UV)物理誘變和亞硝基胍(NTG)化學誘變,抗性篩選得到高產菌株枯草芽孢桿菌OUV23481,產量達到1719 μg/100 g,比出發菌株的產量增加了1倍。王萍等[18]通過響應面的方法對發酵條件進行優化,VK2含量達到(2.2304±0.1115) μg/g。牟杰等[19]通過優化VK2的高密度連續發酵生產工藝,采用高密度連續發酵技術,使5 L罐發酵產量最高達35.58 mg/L。

通過調節微生物發酵的合成機制和合成途徑,選育出VK2高產菌株是發酵法的關鍵[20-22]。本實驗對納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)SD-3進行DES誘變和紫外誘變[23-24]，利用VK2合成途徑中的反饋抑制對納豆芽孢桿菌SD-3進行了L-Phe、L-Tyr以及L-Trp合成缺陷型選育,然后通過響應面法對VK2的發酵工藝條件進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌SD-3 由東北林業大學食品發酵實驗室分離保藏;完全培養基(CM) 酵母浸粉0.5%,胰蛋白胨0.1%,NaCl 0.1%,固體培養基另加2%瓊脂,0.1 MPa滅菌20 min;基本培養基(MM) 葡萄糖 2%,(NH4)2SO40.4%,KH2PO40.1%,MnSO4·H2O 0.01%,MgSO4·7H2O 0.04%,FeSO4·7H2O 0.01%;發酵基礎培養基(FM) 葡萄糖15%,尿素0.8%,(NH4)2SO40.2%,KH2PO40.1%,MnSO4·H2O 0.02%,MgSO4·7H2O 0.08%,FeSO4·7H2O 0.02%,0.5 mL 1%硫胺素,1.0 mL 0.15%生物素,固體培養基另加2%瓊脂,0.1 MPa滅菌20 min;選擇培養基 MM+(酪氨酸)Tyr、MM+(苯丙氨酸)Phe、MM+(色氨酸)Trp、MM+Tyr+Phe、MM+Tyr+Trp、MM+Tyr+Trp;硫胺素、生物素、苯丙氨酸、色氨酸 上海源葉生物科技有限公司;酪氨酸 中國惠世生化試劑有限公司;NaCl、(NH4)2SO4、KH2PO4、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O、尿素 天津市天力化學試劑有限公司;MgSO4·7H2O 天津市光復精細化工研究所;硫酸二乙脂DES 上海凌峰化學試劑有限公司;正己烷 天津市富宇精細化工有限公司;異丙醇 天津市富宇精細化工有限公司;青霉素鈉 上海源葉生物科技有限公司。

YXQG02手提式壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫療器械股份有限公司;SW-CJ-1G超凈工作臺 江蘇凈通凈化設備有限公司;JA2003型電子天平 上海精科儀器有限公司;DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;722s可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;酵母浸粉、胰蛋白胨、瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司;葡萄糖 天津市瑞金特化學品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將在保存在-80 ℃冰箱中菌株解凍復蘇,接種至營養肉湯培養基中活化培養24 h,然后接種到營養瓊脂斜面培養基培養24 h。

1.2.2 液體種子培養 挑取一環活化后斜面培養基中的菌種接種于液體種子培養基中,250 mL三角瓶,裝液量100 mL,溫度37 ℃ 120 r/min培養24 h。

1.2.3 誘變方法

1.2.3.1 生長曲線的繪制 配制液體完全培養基分裝于3個250 mL三角瓶中,每瓶裝液量為100 mL,121 ℃,20 min滅菌,接種量2%,37 ℃ 120 r/min的搖床中培養,每隔2 h在600 nm下測定OD值。用無菌液做為對照,用菌液培養時間為橫坐標,OD值為縱坐標,繪制菌體的生長曲線。

1.2.3.2 菌懸液的制備 取對數期種子液,4000 r/min離心5 min收集菌體,棄上清液并用滅菌后的生理鹽水清洗兩次,得到菌懸液,將菌數調整到105～106CFU/mL備用。

1.2.3.3 物理誘變 取1.2.3.2中所制備的菌懸液10 mL淺層平鋪于直徑9 cm無菌培養皿中,在距離15 W紫外燈一定距離處,照射一定時間,開始照射時啟動計時。將處理后的菌液涂平板,每組做3次平行。將涂好的平板用黑布包裹嚴實,37 ℃倒置培養48 h,確定致死率。

1.2.3.4 DES誘變 取1 mL菌懸液4000 r/min離心5 min,保留菌體,離心洗滌2次,使細胞懸浮于0.1 mol/L無菌磷酸緩沖溶液(pH7.0)中,加入DES溶液,使誘變劑的達到一定的終質量分數,用無誘變劑的磷酸緩沖溶液作為對照。振蕩后置于37 ℃的恒溫培養箱中培養一定時間,培養結束立即加入0.5 mL 25% NaS2SO3,稀釋涂平板,每組做3次平行,37 ℃培養48 h后計算致死率。

1.2.3.5 致死率的測定 將未經誘變處理的菌液(A)與在不同梯度下誘變處理的菌液(B)適當稀釋后,涂布于固體培養基上計算菌落數[25],取致死率為60%～90%之間的組別進行下一步實驗。

1.2.4 菌種誘變單因素實驗

1.2.4.1 紫外照射距離對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 按照1.2.3.2所述方法獲得菌懸液,取菌懸液10 mL淺層平鋪于直徑9 cm無菌培養皿中,分別在距離15 W紫外燈10、15、20、25、30 cm處,照射40 s,開始照射時啟動計時。將處理后的菌液涂平板,每組做3次平行。將涂好的平板用黑布包裹嚴實,37 ℃倒置培養48 h,確定致死率。

1.2.4.2 紫外照射時間對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 按照1.2.3.2所述方法獲得菌懸液,取菌懸液10 mL淺層平鋪于直徑9 cm無菌培養皿中,在距離15 W紫外燈30 cm處,分別照射0、20、40、60、80、100 s,開始照射時啟動計時。將處理后的菌液涂平板,每組做3次平行。將涂好的平板用黑布包裹嚴實,37 ℃倒置培養48 h,確定致死率。

1.2.4.3 DES濃度對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 取1 mL對數期發酵液4000 r/min離心5 min,保留菌體,離心洗滌2次,使細胞懸浮于0.1 mol/L無菌磷酸緩沖溶液(pH7.0)中,加入DES溶液,使誘變劑的終質量分數為0、1%、2%、3%、4%、5%。振蕩后置于37 ℃的恒溫培養箱中培養40 min,培養結束立即加入0.5 mL 25% NaS2SO3,稀釋涂平板,每組做3次平行,37 ℃培養48 h后計算致死率。

1.2.4.4 DES處理時間對納豆芽孢桿菌SD-3的影響 取1 mL對數期發酵液4000 r/min離心5 min,保留菌體,離心洗滌2次,使細胞懸浮于0.1 mol/L無菌磷酸緩沖溶液(pH7.0)中,加入DES溶液,使誘變劑的終質量分數為1%,振蕩后置于37 ℃的恒溫培養箱中分別培養0、15、30、45、60、75 min,培養結束立即加入0.5 mL 25% NaS2SO3,稀釋涂平板,每組做3次平行,37 ℃培養48 h后計算致死率。

1.2.5 發酵培養方法 將新鮮發酵基礎培養基置于120 ℃,滅菌20 min,接入體積分數2%活化后的原始菌株SD-3,37 ℃ 120 r/min搖床培養24 h后,測定發酵液中VK2含量。

1.2.6 VK2的提取與測定 VK2為脂溶性維生素,并且主要在細胞內累積,因此一般采用有機溶劑萃取的方法進行提取。將培養后的發酵液于8000 r/min條件下離心5 min。棄掉上清液,將所得菌體用15 mL蒸餾水制成菌懸液后進行超聲破碎5 min,破碎完畢后加入15 mL正己烷劇烈震蕩2 min,然后于8000 r/min條件下離心5 min。在248 nm處測吸光值,利用標準品的標準曲線計算目標產物的含量,同時用空白樣作對照實驗[26]。

1.2.7 營養缺陷型菌株的檢出與篩選

1.2.7.1 饑餓培養 將5 mL誘變后的菌液4000 r/min離心5 min,無菌生理鹽水離心洗滌三次,接入不含氮源的基本培養基中,使細菌細胞從完全培養基吸收的氮源成分得以充分消耗。

1.2.7.2 青霉素處理淘汰野生型菌株 向無氮培養基中補加等體積的二倍氮源高滲培養基,向其中加入青霉素鈉鹽,并使青霉鈉鹽終濃度為100 μg/mL,37 ℃ 120 r/min培養1.0～1.5 h,離心,洗滌3次,備用,稀釋涂布于MM+Phe、MM+Tyr、MM+Trp、MM+(Phe,Tyr)、MM+(Tyr,Trp)、MM+(Phe,Trp)、MM+(Phe,Tyr,Trp)(100 μg/mL)培養基平板。

1.2.7.3 營養缺陷型菌株的篩選 將培養基中的單菌落用無菌牙簽依次在MM培養基和MM+(Phe,Tyr)、MM+(Tyr,Trp)、MM+(Phe,Trp)、MM+(Phe,Tyr,Trp)(100 μg/mL)培養基上對每一個單菌落進行點種,對應的培養皿中菌落須一一對應,并且進行編號。菌株在MM+(Phe,Trp)上生長,其他補充培養基上不生長,即成功篩選出一株苯丙氨酸和色氨酸雙重營養缺陷型菌株。

1.2.7.4 遺傳穩定性實驗 將補充培養基中的突變株接入發酵培養基中,共傳代5代,同時對五代的菌株均進行液體培養,選出產VK2最多的菌株。

1.2.8 發酵工藝單因素實驗

1.2.8.1 裝液量對納豆芽孢桿菌PT-6產VK2的影響 將培養的菌液按3%接種于分別裝有25、50、75、100、125 mL基礎發酵培養基的250 mL錐形瓶中,置于37 ℃的培養箱中靜止培養24 h,測VK2含量。

1.2.8.2 接種量對納豆芽孢桿菌PT-6產VK2的影響 將培養的菌液分別按1%、2%、3%、4%、5%、6%接種于裝有50 mL基礎發酵培養基的250 mL錐形瓶中,置于37 ℃的培養箱中靜止培養24 h,測VK2含量。

1.2.8.3 溫度對納豆芽孢桿菌PT-6產VK2的影響 將培養的菌液按3%接種于裝有50 mL基礎發酵培養基的250 mL錐形瓶中,發酵溫度分別為 22、27、32、37、42 ℃,置于37 ℃的培養箱中靜止培養24 h,測VK2含量。

1.2.9 響應面法優化VK2的發酵條件 應用Design-Expert軟件中的Box-Benhnken設計構建模型,響應面法尋找最佳發酵條件。以裝液量(A)、接種量(B)、溫度(C),3個因素為自變量,VK2產量為響應值,運用三因素三水平的響應面分析試驗,共17個試驗點。試驗因素水平見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3 數據處理

應用SPSS 17.0軟件中的One-way analysis of vari-ance計算標準差。采用 Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設計進行響應面數據分析。

2 結果與分析

2.1 SD-3生長曲線的測定

SD-3的生長曲線見圖1,由圖1可知,5～15 h為SD-3的對數生長期,該時期的菌種生長最旺盛,突變率高,重現性好。因此,選用對數生長期的SD-3進行菌種誘變。

圖1 納豆芽孢桿菌SD-3的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus natto SD-3

2.2 DES和紫外對SD-3誘變條件的優化

菌種誘變時需要取對數期的菌體,此時細胞生長旺盛,幾乎全部為營養細胞,突變率較高。由圖2a可知,納豆芽孢桿菌SD-3的致死率隨著紫外照射距離的增大而減小,紫外照射距離小于25 cm時菌種致死率過高,正突變率太低,而紫外照射距離大于25 cm時,致死率較低,此時正突變率也較低。因此,紫外照射距離為25 cm時,誘變效果最好。由圖2b可知,納豆芽孢桿菌SD-3的致死率隨著紫外照射時間的增大而增大,當照射時間達到60 s時,SD-3的致死率大于90%,誘變效果較差,當照射時間小于40 s時,SD-3的致死率低于80%,此時正突變率太低。故選擇紫外照射距離為25 cm,照射時間為50 s,此時誘變效果最好。

圖2 DES和紫外照射對納豆芽孢桿菌SD-3的影響Fig.2 Effects of DES and UV irradiation on Bacillus natto SD-3

由圖2c、圖2d可知,SD-3的存活率隨DES誘變時間的延長和DES質量分數的增大而降低。用2% DES處理SD-3時,其致死率大于80%,小于90%,此時正突變率較高。DES質量分數固定不變(1%),處理時間為60 min時,SD-3的致死率在80%～90%之間,當處理時間為70 min時,致死率大于90%,此時正突變率太低。根據誘變育種的經驗和研究可知[27-29],致死率在80%～90%左右獲得正突變株的幾率最高,因此DES處理SD-3的條件應為2% DES,反應60 min。

2.3 營養缺陷型菌株的檢出與篩選

2.3.1 納豆芽孢桿菌SD-3營養缺陷型菌株的選育 將涂布于補充培養基平板中用無菌牙簽挑取36個菌落,圖3可知,在MM上不生長,在MM+(Phe,Trp)生長良好的菌株即為苯丙氨酸和色氨酸雙重營養缺陷型菌株。

圖3 營養缺陷性菌株的初篩結果Fig.3 Screening of auxotrophic strains注:a:MM+(Phe,Trp)培養基;b:MM培養基;圖5同。

由圖4可知,乙酰CoA是異戊二烯側鏈合成的起始化合物,經過甲羥戊酸、異戊烯焦磷酸、牛兒基香葉基焦磷酸等中間物質,合成側鏈聚異戊二烯焦磷酸;而萘醌母環是從4-磷酸赤蘚糖開始,經過莽草酸、分枝酸、異分枝酸、2-琥珀酰-6-羥基-2,4-環己二烯-1-羥酸(SHCHC)以及鄰苯甲酸(OSB)等中間化合物合成;萘醌母環和側鏈經酶催化合成后再經過一步甲基化反應就合成了最終的VK2[30]。

圖4 萘醌(VK2)的生物合成途徑及芳香族氨基酸的反饋抑制Fig.4 Biosynthesis pathway of naphthoquinone(VK2)and feedback inhibition of aromatic amino acids

在VK2的生物合成途徑中,分枝酸是合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸3種芳香族氨基酸的前體物質,因此甲萘醌母環的合成會受到這3種氨基酸的反饋抑制。本實驗在VK2的生物合成途徑及其調節機制的基礎上,依據遺傳育種理論,利用此合成途徑中的反饋抑制對納豆芽孢桿菌SD-3進行L-Phe、L-Tyr以及L-Trp合成缺陷型選育,得到了一株[Phe,Trp]-菌株,即破壞了VK2合成途徑中的苯丙氨酸以及色氨酸路徑的反饋抑制,從而提高了萘醌母環的合成量,達到了提高VK2產量的目的。

2.3.2 納豆芽孢桿菌SD-3營養缺陷型菌株的復篩 將誘變后所得菌株在MM+(Phe,Trp)斜面上傳代培養5次后,再用劃線對照法檢測其穩定性,結果見圖5。從圖5可看出,接種在平板4、6區的2個菌株,在MM+(Phe,Trp)上生長良好,而在MM上不生長,可初步判斷為[Phe,Trp]-菌株,分別編號為PT-4、PT-6。

圖5 營養缺陷型菌株的復檢Fig.5 Retest results of auxotrophic strains

2.3.3 VK2含量測定 由表2可知,篩選出的3株缺陷型菌株的VK2產量較原始菌株的產量有不同程度的提高。經過DES和紫外照射得到的菌株PT-6經5次傳代并發酵培養后的VK2的平均產量達到40.23 mg/L相較于出發菌株SD-3的VK2產量(21.86 mg/L)提高了84.03%。也進一步說明通過切斷L-Phe、L-Trp的代謝支路途徑,可有效提高VK2的產量。

表2 野生型與缺陷型菌株的VK2產量Table 2 The yield of VK2 of wild type and auxotrophic strains

2.4 發酵條件單因素試驗

2.4.1 裝液量對VK2含量的影響 由圖6可知,VK2的產量隨著裝液量的增大呈先增大后減小的趨勢,當裝液量為50 mL時,VK2的產量最高。可能是由于PT-6為需氧菌,裝液量過大會導致溶氧量低,裝液量過小會由于發酵過程中水分蒸發導致菌體早衰,不利于VK2的形成,故選擇裝液量50 mL為零水平進行響應面試驗。

圖6 裝液量對VK2含量的影響Fig.6 Effect of liquid medium volume on VK2 production

2.4.2 接種量對VK2含量的影響 由圖7可知,VK2的產量隨著接種量的增大呈先增大后減小的趨勢,當接種量為3%時,VK2的產量最高。這可能是因為當接種量過大會使營養物質快速消耗,接種量過小會影響菌體內某些輔酶擴散,都不利于VK2的合成,故選擇接種量3%為零水平進行響應面試驗。

圖7 接種量對VK2含量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on VK2 production

2.4.3 溫度對VK2含量的影響 由圖8可知,VK2的產量隨著溫度的增大呈先增大后減小的趨勢,溫度為37 ℃時,VK2含量最高,溫度大于或小于37 ℃時VK2含量都不高,這可能是由于當溫度小于37 ℃時菌體生長較緩慢,而大于37 ℃時雖然菌體生長迅速,但提早進入衰亡期,近而影響VK2的產量。故選擇溫度37 ℃為零水平進行響應面試驗。

圖8 溫度對VK2含量的影響Fig.8 Effect of temperature on VK2 production

2.5 響應面法優化VK2的發酵條件

2.5.1 Box-Behnken實驗設計結果與回歸模型的方差分析 以裝液量(A)、接種量(B)、溫度(C)為考察因素,以VK2含量為響應值,運用 Box-Benhnken 設計17組試驗,Box-Benhnken試驗設計及結果見表3。

利用Design Expert軟件對表3的數據進行多元回歸擬合,得到模型的二次回歸方程:

表3 Box-Benhnken 試驗設計及結果Table 3 Experiment design and results of BBD

Y=52.32-0.53A+0.49B+0.076C+0.18AB+0.41AC+0.12BC-1.76A2-2.02B2-1.58C2

式中:Y:VK2的含量(mg/L);A、B、C:分別代表裝液量(mL)、接種量(%)和溫度(℃)。

回歸模型的方差分析結果見表4。回歸模型P<0.0001,表明回歸模型達極顯著水平;失擬項P=0.8205,不顯著,說明該模型成立。回歸模型中一次項A、B、交互項AC對Y值影響顯著,A2、B2、C2對Y值影響極顯著,其余項不顯著;R2=0.9876線性關系明顯,說明響應值的變化有98.76%來源于所選變量,得到模型擬合程度好,實驗誤差小,可運用該回歸方程對試驗結果進行分析和預測。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)for the quadratic model

2.5.2 響應面曲線及等高線分析 通過等高線和響應面圖可以直觀地看出各個因素間的相互作用,反應各自變量對響應值的影響。固定裝液量、接種量、溫度其中任意一個因素,繪制另兩個因素之間交互作用的等高線和響應面圖,見圖9。等高線形狀若趨于橢圓形,則兩自變量之間交互作用明顯,趨于圓形則反之;等高線密度大,表明因素間交互作用較強。響應面曲面的傾斜度越高,即坡度越陡,說明因素間交互作用越顯著,隨著變化趨勢的劇烈增加,曲面顏色也呈加深趨勢。由圖9可以看出,裝液量(A)和溫度(C)交互作用顯著,裝液量(A)和接種量(B)、接種量(B)和溫度(C)交互作用不顯著,與表4中方差分析結果一致。

圖9 裝液量、接種量、溫度交互作用對VK2含量影響的響應面曲線及等高線Fig.9 Response surface plots and contour line of effects of interaction between liquid medium volume,inoculation amount and temperature on VK2 production

2.5.3 VK2發酵工藝條件的確定及回歸模型的驗證試驗 利用Design-Expert 8.0.6分析得到VK2的最佳發酵工藝條件理論值為:裝液量63.75 mL,接種量3.08%,溫度37.6 ℃,理論VK2含量可高達51.5976 mg/L。考慮到實驗操作的可行性將最佳發酵工藝條件調整為:裝液量64 mL,接種量3%,溫度38 ℃,經過3次平行試驗,測得實際VK2含量為51.23 mg/L，與理論值相差較小,說明通過響應面優化后的發酵條件參數可靠,具有一定的實踐指導價值，且VK2的最終產量相較初始菌株SD-3提高了134.35%。

3 結論

本實驗首先以納豆芽孢桿菌SD-3為出發菌株,采用DES誘變和紫外誘變的方法構建VK2高產菌株。DES誘變處理最佳條件為DES質量分數2%,反應時間60 min,紫外誘變最佳條件為照射距離25 cm,照射時間50 s。經過多次篩選最終獲得1株具有分枝酸-Trp/Phe/Tyr代謝途徑,Phe-和Trp-合成缺陷的雙重營養缺陷型VK2高產菌株PT-6;連續傳代5次,同時對五代的菌株進行液體培養,VK2的發酵產率平均達到40.23 mg/L,較出發菌株產VK2水平(21.86 mg/L)提高84.03%,然后考察了裝液量、接種量、溫度3個因素對VK2含量的影響,并采用響應面法優化了VK2發酵工藝條件。結果表明最佳發酵條件為:裝液量64 mL,接種量3%,溫度38 ℃,在此優化條件下VK2含量達到了51.23 mg/L。本實驗表明菌種誘變選育出的高產菌株具有良好的遺傳穩定性,通過響應面法對發酵條件進行優化后顯著提高了VK2含量,為工業上生產VK2提供參考依據,具有一定的工業化生產潛力。