嘔吐毒素脫毒菌Devosia sp. 發酵培養基優化

鄒球龍,金 康,黎 琪,張云鵬,李曉敏,張忠鑫,印 鐵,*

(1.中糧營養健康研究院,北京 102209;2.北京市畜產品質量安全源頭控制工程技術研究中心,北京 102209;3.蚌埠學院食品與生物工程學院,安徽蚌埠 233030;4.營養健康與食品安全北京市重點實驗室,北京 102209)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),又稱嘔吐毒素,是谷物和飼料中常見的一種單端孢霉烯族毒素,主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產生[1-3]。嘔吐毒素在代謝過程中抑制核酸和蛋白質的合成,能引發人類和動物多種慢性疾病,如腸道炎癥、發育不良和生殖系統紊亂等,已經被國際癌癥研究機構列為三類致癌物之一[4-7]。目前,谷物中嘔吐毒素的脫除方法主要為物理吸附和理化降解等,當前已知的物理吸附劑對嘔吐毒素吸附效果不佳,且吸附作用不具有特異性,容易造成營養物質的損失且毒素并沒未完全被降解,仍可能造成環境的二次污染;采用臭氧、紫外、輻照等理化手段對嘔吐毒素進行降解的谷物,存在引入外源污染及降解產物安全性不明等問題而被禁止作為食品及飼料原料進入市場[8]。

由于生物脫毒法具有條件溫和、安全高效等特點,我國允許將毒素超標的糧食通過生物法脫除至限量標準之內進入飼料領域。隨著物理、化學脫毒手段弊端的不斷出現和人們對迅猛發展的生物技術優點的認識增加,國內外利用微生物進行真菌毒素脫毒的研究正在逐步展開,而且相關研究成果表現出了良好的開發和應用前景[8-12]。以嘔吐毒素的生物脫毒為例,動物胃腸道微生物可將DON去環氧化,變成DOM-1,但是由于培養條件等限制并未得到純化菌株[13-15]。塔賓曲霉能夠通過羥基化對DON進行轉化,但轉化產物未鑒定[16]。JUN等研究發現一株農桿菌屬根瘤菌能夠將DON氧化成3-keto-DON,使其毒性降至DON的十分之一以下[17]。Yoko等從麥田中分離到一株特殊的諾卡氏菌WSN05-2,它能將DON差向異構化成3-epi-DON[18]。Karl等鑒定了水稻中的一個UDP-糖基轉移酶,通過在第3位C的羥基上連上一個葡萄糖基,來減小DON毒性[19]。近年來研究表明德沃斯氏菌(Devosiasp.)可以安全高效脫除嘔吐毒素,其產生兩種酶(DepA和DepB),DepA為氧化酶,DepB為還原酶,通過一步氧化與一步還原反應達到將DON中3位羥基差向異構的效果,形成嘔吐毒素立體異構體(3-epi-DON),是目前已知的較為安全的嘔吐毒素轉化產物[20-24]。

發酵液中菌體濃度與其脫毒效率正相關,本研究針對德沃斯氏菌生物量低導致脫毒成本高的問題,通過響應面方法對1株德沃斯氏菌(Devosiasp. 1.10745)的培養條件進行優化,以期為進一步利用德沃斯氏菌進行DON生物脫毒的相關工業化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

德沃斯氏菌(Devosiasp.)1.10745 購自中國科學院微生物所菌種保藏中心(CGMCC);酵母浸粉 安琪酵母股份有限公司;酵母膏 北京奧博星生物技術有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨 英國OXOID公司;DON標準品 青島普瑞邦生物工程有限公司;磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳等其他試劑 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf股份有限公司;MQD-B2T振蕩培養箱 上海旻泉儀器有限公司;UV-8000紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司);SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州蘇凈安泰空氣技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 種子培養基(LB培養基):酵母提取物(5 g/L)、胰蛋白胨(10 g/L)、NaCl(10 g/L),121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基:碳、氮源種類和添加量按照各實驗的方案設計配制;初始培養基母液無機鹽及微量元素添加量:磷酸氫二鉀2 g/L,硫酸銨3 g/L,硫酸鎂1 g/L,氯化鈣0.01 g/L,硫酸亞鐵0.01 g/L,硫酸錳0.01 g/L,pH7.0,115 ℃滅菌30 min。

1.2.2Devosiasp.培養條件 種子和發酵均采用250 mL三角瓶于30 ℃進行搖瓶(240 r/min)培養。其中,種子培養和發酵培養的時長分別為24和40 h;種子及發酵培養基體積均為50 mL。

1.2.3 生物量的測定 德沃斯氏菌的發酵生物量以搖瓶培養結束后液體培養基的OD600表示。

1.2.4 碳、氮源單因素實驗

1.2.4.1 發酵培養基碳源的選擇 在LB培養基的基礎上,固定氮源(酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L)與無機鹽(NaCl 10 g/L)添加量水平,分別選取葡萄糖(10 g/L)、蔗糖(10 g/L)與糊精(10 g/L)3種物質作為碳源,研究碳源種類對Devosiasp.生長的影響。

1.2.4.2 發酵培養基氮源的選擇 根據前期碳源單因素實驗結果,確定以蔗糖作為碳源,再選取酵母浸粉(安琪酵母,FM888)、酵母膏或玉米漿干粉混合作為氮源?；旌系粗?種物質的添加量如表1所示,第9組為對照初始培養基。

1.2.5 部分因子試驗 基于前期單因素實驗結果,選取蔗糖、酵母浸粉、酵母膏、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣以及硫酸亞鐵共8個因素,各因素均分別設計2個水平。采用Design Expert 7.0軟件進行部分因子試驗(FFD,Fractional Factorial Design)的試驗設計、數據分析與模型的建立,篩選影響德沃斯氏菌生長的關鍵培養基成分。培養基其它成分的添加量與原配方保持一致。8個因素的編碼及水平見表2。

表2 部分因子試驗設計因素編碼及水平Table 2 Part factor test design factor coding and level

1.2.6 最陡爬坡實驗 根據FFD試驗結果中顯著因子的效應大小選取A(酵母浸粉)、B(酵母膏)與C(蔗糖)3個最大影響因素進行最陡爬坡試驗,并確定最陡爬坡試驗的方向和步長。具體因素及水平見表3，硫酸胺、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣和硫酸亞鐵分別為2、2、0.7、0.02和0.02 g/L。

表3 最陡爬坡實驗設計Table 3 Experiment design for steepest climb

1.2.7 中心組合試驗 根據最陡爬坡試驗確定的酵母浸粉、酵母膏和蔗糖3個因素的中心點分別為6、8和10 g/L。培養基無機鹽及微量元素添加量同最陡爬坡試驗。采用CCD(Central composite experimental design)中心組合試驗設計進行響應面優化實驗,編碼及水平見表4。

表4 中心組合實驗因素及水平Table 4 Central combination of experimental factors and levels

1.2.8 菌體對DON脫毒效果驗證 將優化后及對照組的菌液同時稀釋至OD600=2,分別取250 mL加入等體積的10 ppm的嘔吐毒素(最終生物量為OD600=1、DON為5 ppm),30 ℃反應0.5h及1 h之后,同時加入0.5 mL甲醇終止反應,離心取上清進行液相色譜檢測DON濃度并計算毒素脫除率。

1.2.9 DON的液相色譜檢測條件及標準曲線的繪制 SHIMADZU 5 μm C18反相柱(250 mm×4.6 mm);流動相為甲醇/水(體積比20/80),流速為1 mL/min;紫外檢測器,波長218 nm。取DON儲備液(1000 ppm)用流動相分別稀釋至0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10 ppm的工作液,進樣20 μL,重復測定三次取平均值。根據濃度與峰面積關系繪制DON標準曲線,得出方程為:DON含量(y)=峰面積(x)/10412,決定系數R2=0.9994,此方程具有良好的線性關系。

1.2.10 DON脫除率計算 DON脫除率=(脫除前DON濃度-脫除之后DON濃度)/脫除前DON濃度×100

1.3 數據處理

所有測定重復3次取平均值,實驗數據采用Excel和Design Expert 7.0等軟件處理分析。

2 結果與分析

2.1 碳、氮源單因素實驗

2.1.1 碳源的確定 培養基中的營養成分是菌種賴以生長的物質基礎,碳源是微生物培養基的主要成分之一,它既是微生物生命活動所需要的能源物質,同時又是代謝產物和構成菌體細胞的主要元素的來源。如圖1所示,選用蔗糖作為碳源時,Devosiasp.的OD600顯著(P<0.05)高于葡萄糖和糊精,故選擇蔗糖作為下一步試驗的碳源。

圖1 碳源對生物量的影響Fig.1 Effect of carbon source on biomass注:不同小寫字母表示具有顯著性差異,P<0.05。

2.1.2 氮源的確定 培養基中的氮源可以為微生物的生命活動提供氮元素,用以合成蛋白質、氨基酸、核酸等生命大分子物質。如表5所示,第1、3、4號搖瓶中Devosiasp.的OD600值相對較高,且以第4號>第1號>第3號。綜合考慮成本與氮源物質的穩定性,選擇第1號酵母浸粉與酵母膏的組合作為部分因子試驗中的基本氮源組成。

表5 氮源對生物量的影響Table 5 Effects of nitrogen sources on biomass

2.2 根據部分因子試驗結果篩選主要因素

FFD試驗可在多個影響因素中快速且有效地篩選出相對較為重要的因素,并提供如何組合該因素以改進工藝的有效信息。如表6所示,采用Design Expert 7.0軟件對FFD試驗的結果進行統計分析,各因素的主要效應分析見表7。

表6 部分因子試驗設計及結果Table 6 Rsults of part factor test design

表7 各因素的主要效應Table 7 Main effect of each factor

通過方差分析,模型F值是5.25，P<0.05,表明模型是顯著的,由試驗結果可知,在部分因子試驗的培養基成分中,對德沃斯氏菌生物量有顯著影響的因素為B、AB和H。盡管A的影響未達差異顯著水平,但由于其與B的交互作用顯著,故后續實驗仍選用A作為考察的影響因素。

根據FFD試驗設計原理,利用Design Expert 7.0軟件對實驗數據進行二次多元回歸擬合,以Devosiasp.的生物量(以OD600表示)為響應值,得到回歸方程為Y=3.58+0.1A+0.15B+0.004973C-0.069D-0.003286E+0.02F+0.006602G+0.22H-0.11AB。

由于部分因子試驗無法確定實驗結果是否在最佳響應值區域,因此,選取酵母浸粉、酵母膏和蔗糖作為影響因子進行最陡爬坡實驗,以確定這3個因素的最優響應值區域；根據回歸方程系數判定，酵母浸粉、酵母膏與蔗糖均為正效應，故應增加其添加量。由于在FFD試驗中，其余成分不具有顯著性，因此將其余成分固定在零水平,即磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸銨2 g/L、硫酸鎂0.7 g/L、氯化鈣0.02 g/L、硫酸亞鐵0.02 g/L。

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡法的爬坡方向即為實驗值的變化方向,變化步長由各因素效應值的大小決定,能經濟、快速地接近最佳響應值區域。最陡爬坡試驗結果見表8。由實驗結果可知,第2號的OD600達到最高,故選擇第2號的培養基添加量作為中心組合實驗的中心點,即酵母浸粉(A)6 g/L,酵母膏(B)8 g/L,蔗糖(C)10 g/L。

表8 最陡爬坡實驗結果Table 8 Results of steepest climb

2.4 中心組合試驗及響應面分析

響應面法是目前最常用的微生物培養基優化方法之一,可用于確定各因素及其交互作用在工藝過程中對指標(響應值)的影響,較為精確地表述因素和響應值之間的關系,優化各因素響應值到最佳水平,以縮短優化時間和提高應用的可信度。

為檢驗該三次多元回歸方程的有效性,進一步對生物量的顯著性和多元回歸模型的方差進行分析,其分析結果見表10。由表10可知,回歸模型檢驗的P<0.01,表示該回歸模型極顯著;失擬項P>0.05為不顯著,決定系數R2=0.997,說明回歸模型與實際情況擬合程度高,適合解釋和預測生物量。

表9 中心組合試驗設計及結果Table 9 Results of central combination of experiment

表10 多元回歸模型方差分析表Table 10 Analysis of varianceanalysis of multiple regression model

由圖2可知,酵母浸粉和酵母膏對生物量的影響,其響應面圖曲面坡度陡峭,等高線趨于橢圓形,說明酵母浸粉和酵母膏交互作用對生物量的影響大,交互作用顯著。同理,由圖3和圖4可知,蔗糖與酵母浸粉和酵母膏的交互等高線圖呈明顯的橢圓形,說明交互作用對生物量有顯著影響。

圖2 三次線性模型中酵母浸粉和酵母膏的響應面和對應的等高線Fig.2 Response surface plot and corresponding contour map of yeast extracts powder and yeast extract in the cubic linear model

圖3 三次線性模型中酵母浸粉和蔗糖的響應面和對應的等高線Fig.3 Response surface plot and corresponding contour map of yeast extracts powder and sucrose in the cubic linear model

圖4 三次線性模型中酵母膏和蔗糖的響應面和對應的等高線Fig.4 Response surface plot and corresponding contour map of yeast extracts and sucrose in the cubic linear model

通過數據分析得到回歸模型存在最大值點,Y的最大估計值為21.62,各個因素的取值分別為酵母浸粉10.00 g/L,酵母膏6.49 g/L,蔗糖8.40 g/L。在以上優化條件下進行驗證試驗,共進行4個重復,得到OD平均值為21.66,與預測值21.62的相對誤差為0.185%?？梢?使用該回歸模型優化德沃斯氏菌發酵培養基成分是可行的。

2.5 菌體對DON脫毒效果驗證

在生物量為OD600=1、DON濃度為5 ppm的條件下,優化前后單位菌體對DON的降解效率差異不顯著(圖5),故生物量提高也就直接反映出其脫毒能力的提高。

圖5 單位菌體對DON脫毒效率比較Fig.5 Compared with the detoxification efficiency of bacteria to DON

3 結論

本文以反應脫毒效率的生物量為指標,通過碳源、氮源單因素試驗確定了Devosiasp.生長的最適碳、氮源及其添加量,利用部分因子試驗選出酵母浸粉、酵母膏和蔗糖3個最大影響因素,經最陡爬坡試驗確定了3個因素水平的最佳響應區域,再通過中心組合實驗,對最大影響因素建立了二次多元回歸模型,優化了因素水平,得到最優培養基配方為:酵母浸粉10.00 g/L,酵母膏6.49 g/L,蔗糖8.40 g/L,硫酸銨2 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L,硫酸鎂0.7 g/L,氯化鈣0.02 g/L和硫酸亞鐵0.02 g/L。經驗證,所得OD600為21.66,與預測值21.62基本相符,相對最初生物量(OD600)增長了89.1%,即優化后的發酵液對DON的脫除效率增加了89.1%。由此可見,通過響應面法優化德沃斯氏菌發酵培養基是行之有效的。后續將在此結果的基礎上,進行補料批次發酵條件優化,進一步提高Devosiasp.發酵培養的生物量,為該嘔吐毒素脫毒菌株工業規模生產奠定基礎。