水解度對牡蠣酶解液特性的影響

楊 昭,姚玉靜,黃佳佳,梁志理,陳麗珊,陳曉賢

(廣東食品藥品職業學院食品學院,廣東廣州 510520)

牡蠣是世界上第一大養殖貝類,也是我國四大養殖貝類之一,它肉嫩味鮮,營養豐富,被稱為“海洋牛奶”[1]。牡蠣酶解產物具有抑制血管緊張素轉換酶(angiotensin-I converting enzyme,ACE)、免疫增強、抗疲勞、抗氧化等多種生理活性,在功能性食品開發領域具有較大的應用前景[2-5]。

生物活性肽多以非活性狀態存在于蛋白質的長鏈中,當用適宜的蛋白酶水解時,其活性分子片段被釋放出來[6]。同種蛋白酶水解相同的蛋白質,水解度對酶解產物組成、呈味特性、功能特性和生理活性起著主要影響。中華鱘蛋白質水解物中粗蛋白含量、氨基酸總量、溶解性和抗氧化活性隨著水解度的增大而升高[7]。鰱魚酶解產物的ABTS+·清除率、脂質過氧化抑制率及還原能力均隨水解度增大而升高[8]。香港牡蠣的水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白經堿性蛋白酶水解后,隨著水解度的增大,溶解性逐漸增強,而蛋白的乳化性和乳化穩定性先升高后下降[9]。國內外關于牡蠣蛋白酶解研究主要集中在酶解工藝優化和生理活性研究方面[10-11]。水解度對牡蠣酶解產物感官評分、肽分子量分布和游離氨基酸組成等特性的研究較少。鑒于水解度對酶解產物的組成具有重要的影響,而酶解產物的組成是呈味特性、功能特性和生理活性的物質基礎。因此,探究不同水解度牡蠣酶解液的感官評分、肽分子量分布和氨基酸組成對于其在食品工業中的應用具有重要意義。

本研究以牡蠣為原料,采用胰蛋白酶限制性水解牡蠣肉,制得不同水解度的酶解液,考察水解度對牡蠣酶解液感官評分、肽分子量分布和游離氨基酸組成及評價的影響,為牡蠣蛋白質資源的工業化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣肉(凍藏) 購于廣州黃沙水產市場;胰蛋白酶(4 000 U/g) 重慶市全新祥盛生物制藥有限公司;卵清蛋白、細胞色素C、維生素B12、抑肽酶、氨基酸混合標準品 美國Sigma-Aldrich公司;蔗糖、食用鹽、味精 市售(食品級);其他試劑 均為分析純。

FE22-Standard pH計 梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;DKZ-3B電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學儀器有限公司;3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司;K9840凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;LC-20A高效液相色譜儀 日本島津制作所;L8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同水解度牡蠣酶解液制備 參照楊昭等[12]的方法進行調整。凍藏牡蠣肉置于室溫溶解后,按照1∶1的質量比加入蒸餾水,打漿,調整溶液pH至7.0后(酶解過程中每隔30 min 調1次pH,確保pH維持在7.0),加入牡蠣肉質量0.4%的胰蛋白酶,攪拌均勻,在55 ℃下震蕩酶解不同時間。酶解結束后煮沸20 min滅酶,4 ℃條件下8000 r/min離心20 min,取上清液即為牡蠣酶解液,-18 ℃凍存備用。按照上述方法,分別酶解0、0.5、2、4、8、10 h,獲得水解度為0、15.98%、27.59%、35.83%、43.27%、62.02%牡蠣酶解液,分別標記為DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%。

1.2.2 水解度測定 水解度測定采用甲醛滴定法[13]。

1.2.3 感官評價 參照姚玉靜等[13]的方法進行感官評價。滋味標準品分別是鮮味(0.2%味精)、甜味(1%蔗糖)、咸味(0.35%食用鹽)、酸味(0.04%檸檬酸)和苦味(0.02 g/L鹽酸奎寧)。使用5點線性坐標,將標準品梯度稀釋,最高濃度感官分值為10分,最低濃度感官分值為2分,每下降一個梯度,感官分值下降2分。樣品稀釋3倍,采用感官定量分析對樣品進行感官評價。

1.2.4 肽分子量分布測定 肽分子量分布測定采用高效液相色譜法[6]。其中肽標準品分別為維生素B12(1355 Da)、抑肽酶(6512 Da)、細胞色素C(12384 Da)和卵清蛋白(43000 Da)。根據肽標準品出峰時間和分子量大小的對數作肽分子量標準曲線方程:y=-0.3109x+6.9925(R2=0.9932)。

1.2.5 游離氨基酸組成測定 根據GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》進行酶解液氨基酸組成測定。

1.2.6 游離氨基酸TAV分析 采用呈味強度值(taste activity value,TAV)評價游離氨基酸對酶解液滋味的貢獻,即樣品中各游離氨基酸的含量與該游離氨基酸閾值之比[14]。當TAV>1 時,表明該氨基酸對樣品呈味有重要貢獻,并且數值越大,貢獻越大。而TAV<1時,表明該氨基酸對樣品呈味貢獻不大[15]。

1.3 數據處理

數據采用Excel 2010進行分析處理,SPSS 20.0軟件進行數據差異顯著性分析。數據以平均值±標準偏差表示,P<0.05為差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 水解度對牡蠣酶解液感官特性的影響

牡蠣酶解是一個復雜的蛋白質降解過程,在不同酶解時期,原料蛋白質結構、酶切位點會發生變化,導致最終酶解液的組成也有所不同,因此,不同酶解程度酶解液的感官特性也存在差異[16]。由圖1可知,水解度為0的酶解液,鮮味、咸味、酸味、甜味和苦味分值均較低。這可能是因為牡蠣蛋白質未被酶解,大分子的蛋白質沒有降解為呈味的小分子肽和游離氨基酸。隨著水解度的增大,牡蠣酶解液的鮮味、酸味和甜味,呈現先增加后降低的趨勢。其中水解度在0～43.27%之間,鮮味、酸味和甜味呈現增加趨勢,水解度在43.27%～62.02%之間,鮮味、酸味和甜味呈現降低趨勢。水解度為43.27%的牡蠣酶解液,獲得最高分值的鮮味、酸味和甜味評分,并顯著高于其他5組酶解液(P<0.05)。牡蠣酶解液的咸味和苦味,隨著水解度的增大呈現一直增加的趨勢。水解度為62.02%的牡蠣酶解液,獲得最高分值的咸味和苦味評分,其苦味評分顯著高于其他5組酶解液(P<0.05)。整體來看,水解度為43.27%的牡蠣酶解液具有最佳的滋味特征,強烈的鮮味和甜味,弱的不良風味。此研究結果與侯清娥[17]采用胰蛋白酶獲得水解度為45.55%酶解液,具有濃郁海鮮風味、甘甜、微酸的感官描述一致。

圖1 不同水解度牡蠣酶解液的感官評分Fig.1 Sensory score of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree注:不同小寫字母表示相同指標不同水解度差異顯著(P<0.05),圖2同。

2.2 水解度對牡蠣酶解液肽分子量分布的影響

蛋白質酶解產物肽分子量分布是其最重要的性質之一,將會影響酶解產物作為功能性食品材料的應用[18]。多項研究表明大分子蛋白質水解成小分子肽會提高溶解性[19]、降低起泡性[20],而抗氧化活性呈現先升高后降低的趨勢[21]。牡蠣蛋白的乳化性和乳化穩定性隨著水解度的增加也呈現先升高后下降的趨勢[14]。酶解產物的呈味特性、功能特性和生理活性與其肽分子量分布密切相關,因此有必要探究水解度對牡蠣酶解液肽分子量分布的影響。

由圖2可知,水解度對牡蠣酶解液肽分子量分布影響較大。隨著水解度的增大,分子量>10 kDa和5～10 kDa肽比例逐漸減少,3～5 kDa肽比例先增加后減少,1～3 kDa和<1 kDa肽比例逐漸增大。分子量<5 kDa的肽可能會呈現滋味特征,而分子量>5 kDa的肽無滋味[22]。分子量為3～5 kDa 肽段的扇貝裙邊酶解液能夠明顯貢獻濃厚味,使其滋味更加豐富[19]。分子量<3 kDa的牡蠣酶解液,具有最強的ACE 抑制活性[2]。分子量<6 kDa的牡蠣酶解液具有較強的抗氧化和抗疲勞活性[4]。因此,分子量<5 kDa的肽可能具有較強的呈味特性和生理活性,值得深入研究。DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中<5 kDa肽比例分別為40.14%、46.12%、66.56%、70.52%、74.74%和76.18%。<1 kDa肽比例最高的是DH62.02%酶解液(18.68%),其次是DH43.27%酶解液(18.18%),兩者之間不存在顯著性差異。1～3 kDa肽比例最高的是DH62.02%酶解液(36.04%),其次是DH43.27%酶解液(35.06%),兩者之間無顯著性差異。水解度對3～5 kDa肽比例影響較小,DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中3～5 kDa肽比例分別為19.32%、20.26%、23.37%、22.46%、21.49%和21.47%。上述酶解感官分析過程中,水解度為43.27%的牡蠣酶解液具有強烈的鮮味和甜味,與其中含有豐富的小肽有關。

圖2 不同水解度牡蠣酶解液的肽分子量分布范圍Fig.2 The range of peptide molecular weight of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

2.3 水解度對牡蠣酶解液游離氨基酸組成的影響

游離氨基酸是蛋白質酶解液中重要的滋味和香味前體物質[2]。牡蠣酶解液中的游離氨基酸是重要的美拉德反應底物,對于美拉德反應改善牡蠣酶解液的風味、營養和抗氧化活性有較大的影響[24]。因此,探究不同水解度牡蠣酶解液游離氨基酸的組成和含量,對于酶解液的應用具有重要的意義。

由表1可知,不同水解度的牡蠣酶解液均含有16種氨基酸。從單一氨基酸檢測結果上看,隨著水解度的增大,6種水解度牡蠣酶解液中16種游離氨基酸含量均呈現逐漸增大的趨勢。其中亮氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸和異亮氨酸含量變化趨勢最為明顯。DH0酶解液中游離氨基酸含量最高的是丙氨酸(0.590 mg/g),其次是甘氨酸(0.480 mg/g)和精氨酸(0.449 mg/g)。丙氨酸、甘氨酸和精氨酸百分比分別是13.53%、11.01%和10.31%。DH15.98%酶解液中游離氨基酸含量最高的是精氨酸(0.941 mg/g),其次是丙氨酸(0.921 mg/g)和賴氨酸(0.779 mg/g)。精氨酸、丙氨酸和賴氨酸百分比分別是11.01%、10.78%和9.12%。DH27.59%酶解液中游離氨基酸含量最高的是精氨酸(1.299 mg/g),其次是賴氨酸(1.201 mg/g)、丙氨酸(1.200 mg/g)和亮氨酸(1.200 mg/g)；精氨酸、賴氨酸、丙氨酸和亮氨酸百分比分別是10.24%、9.46%、9.45%和9.45%。DH35.83%酶解液中游離氨基酸含量最高的是精氨酸(1.600 mg/g),其次是谷氨酸(1.599 mg/g)、亮氨酸(1.501 mg/g)、賴氨酸(1.501 mg/g)和丙氨酸(1.501 mg/g)；精氨酸、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸和丙氨酸百分比分別是9.61%、9.6%、9.02%、9.01%和9.01%。DH43.27%酶解液中游離氨基酸含量最高的是精氨酸(1.802 mg/g),其次是賴氨酸(1.8 mg/g)、丙氨酸(1.8 mg/g)和亮氨酸(1.8 mg/g)；精氨酸、賴氨酸、丙氨酸和亮氨酸百分比分別是9.30%、9.29%、9.29%和9.29%。DH62.02%酶解液中游離氨基酸含量最高的是谷氨酸(1.901 mg/g),其次是賴氨酸(1.801 mg/g)、丙氨酸(1.801 mg/g)、精氨酸(1.8 mg/g)和亮氨酸(1.8 mg/g)；谷氨酸、賴氨酸、丙氨酸、精氨酸和亮氨酸百分比分別是9.49%、9.49%、8.99%、8.99%和8.99%。

表1 不同水解度牡蠣酶解液的氨基酸組成Table 1 Free amino acids composition of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

隨著水解度的增大,DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中游離氨基酸總含量呈現逐漸增加的趨勢,分別為4.359、8.543、12.695、16.653、19.383和20.024 mg/g。DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中游離氨基酸總含量是DH0酶解液的2.0、2.9、3.8、4.4和4.6倍。6種酶解液的必需氨基酸含量隨著水解度的增大而增加。DH62.02%酶解液的必需氨基酸含量最高(9.303 mg/g),其次為DH43.27%酶解液(9.133 mg/g)。

2.4 水解度對牡蠣酶解液游離氨基酸呈味特性的影響

酶解液中的游離氨基酸組成、含量、百分比和閾值對其滋味有較大的影響。依據各游離氨基酸的呈味特征,把氨基酸分為鮮味、甜味、苦味和無味(芳香族氨基酸)[25]。由圖3可知,隨著水解度的增大,鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均呈現逐漸增加的趨勢,芳香族氨基酸呈現先增加后降低的趨勢。鮮味氨基酸含量最高的是DH62.02%酶解液(4.402 mg/g),其次為DH43.27%酶解液(4.069 mg/g)。甜味氨基酸含量最高的是DH62.02%酶解液(6.920 mg/g),其次為DH43.27%酶解液(6.581 mg/g)。苦味氨基酸含量最高的是DH62.02%酶解液(6.401 mg/g),其次為DH43.27%酶解液(6.333 mg/g)。芳香族氨基酸含量最高的是DH43.27%酶解液(2.399 mg/g),其次為DH62.02%酶解液(2.301 mg/g)。

圖3 不同水解度牡蠣酶解液的呈味氨基酸含量Fig.3 The content of flavor amino acids of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

由圖4可知,隨著水解度的增大,6種酶解液中鮮味氨基酸的百分比緩慢增加,苦味氨基酸的百分比緩慢增加后逐漸減少,甜味氨基酸的百分比逐漸減少后趨于穩定。6種水解度酶解液中具有較佳滋味的鮮味氨基酸和甜味氨基酸之和均大于50%。鮮味氨基酸百分比最大的是DH62.02%酶解液(21.98%),其次為DH43.27%酶解液(20.99%)。甜味氨基酸百分比最大的是DH0酶解液(45.62%),其次為DH15.98%酶解液(37.12%)。苦味氨基酸百分比最大的是DH27.59%酶解液(33.08%),其次為DH35.83%酶解液(32.74%)。

圖4 不同水解度牡蠣酶解液的呈味氨基酸百分比Fig.4 The percentage of flavor amino acids of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

然而,由于各氨基酸的味覺閾值不同,呈味氨基酸含量高和百分比高的酶解液并不一定具有最佳的感官評分[26]。由表2可知,隨著水解度的增大,6種酶解液中TAV>DH0酶解液中TAV>1的氨基酸只有1種,是谷氨酸(1.30)。DH15.98%酶解液中TAV>1的氨基酸有4種,分別是谷氨酸(2.23)、精氨酸(1.88)、賴氨酸(1.56)和丙氨酸(1.54)。DH27.59酶解液中TAV>1的氨基酸有7種,分別是谷氨酸(3.34)、精氨酸(2.60)、賴氨酸(2.40)、丙氨酸(2.00)、纈氨酸(1.70)、蛋氨酸(1.33)和組氨酸(1.20)。DH35.83%酶解液中TAV>1的氨基酸有8種,分別是谷氨酸(5.33)、精氨酸(3.20)、賴氨酸(3.00)、丙氨酸(2.50)、纈氨酸(2.35)、蛋氨酸(1.74)、組氨酸(1.70)和苯丙氨酸(1.04)。DH43.27%酶解液中TAV>1的氨基酸有9種,分別是谷氨酸(5.66)、精氨酸(3.60)、賴氨酸(3.60)、丙氨酸(3.00)、纈氨酸(2.75)、蛋氨酸(2.10)、組氨酸(1.90)、苯丙氨酸(1.33)和異亮氨酸(1.11)。DH62.02%酶解液中TAV>1的氨基酸有9種,分別是谷氨酸(6.34)、精氨酸(3.60)、賴氨酸(3.60)、丙氨酸(3.00)、纈氨酸(2.75)、組氨酸(2.10)、蛋氨酸(2.00)、苯丙氨酸(1.33)和異亮氨酸(1.11)。6種水解度牡蠣酶解液中谷氨酸TAV值均大于1,且隨著水解度的增大TAV值呈現逐漸增大的趨勢,表明谷氨酸是6種水解度牡蠣酶解液游離氨基酸中最主要的呈鮮物質。劉海梅等[27]采用Protemax復合蛋白酶水解牡蠣肉,也發現酶解液中含有豐富的鮮味氨基酸,其中谷氨酸含量最高。

表2 不同水解度牡蠣酶解液游離氨基酸的TAVTable 2 Taste activity values of free amino acids of oyster hydrolysates with different hydrolysis degree

3 結論

本研究以牡蠣為原料,采用胰蛋白酶水解牡蠣肉,通過控制酶解時間制得水解度在0～62.02%之間的6種酶解液。探究水解度對牡蠣酶解液感官、肽分子量分布和游離氨基酸組成與評價的影響。結果表明,隨著水解度的增大,牡蠣酶解液的鮮味、酸味和甜味評分先增加后降低,咸味和苦味一直增加。水解度為43.27%的牡蠣酶解液,獲得最高分值的鮮味、酸味和甜味評分。隨著水解度的增大,分子量>10 kDa和5～10 kDa肽比例逐漸減少,3～5 kDa肽比例先增加后減少,1～3 kDa和<1 kDa肽比例逐漸增加。DH0、DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中<5 kDa肽比例分別為40.14%、46.12%、66.56%、70.52%、74.74%和76.18%。<1 kDa和1～3 kDa肽比例最高的是DH62.02%酶解液。6種水解度牡蠣酶解液中各游離氨基酸含量、游離氨基酸總含量、必需氨基酸含量隨著水解度的增大而呈現逐漸增大的趨勢。DH15.98%、DH27.59%、DH35.83%、DH43.27%、DH62.02%酶解液中游離氨基酸總含量是DH0酶解液的2.0、2.9、3.8、4.4和4.6倍。鮮味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸含量均隨著水解度的增大而逐漸增加,芳香族氨基酸先增加后降低。隨著水解度的增大,6種酶解液中TAV>1的氨基酸數量逐漸增多。6種水解度牡蠣酶解液中谷氨酸TAV值均大于1,且隨著水解度的增大TAV值呈現逐漸增大的趨勢,表明谷氨酸是6種水解度牡蠣酶解液中最主要的呈鮮氨基酸。牡蠣酶解液中富含豐富的小分子肽和游離氨基酸,下一步應對小分子肽進行分離鑒定,并研究美拉德反應對不同水解度牡蠣酶解液呈味特性、功能特性和生理活性的影響,為牡蠣蛋白質資源的工業化應用提供理論依據。