水熱糖基化大米蛋白質的結構以及溶解性研究

李靈誠,李兵兵,夏 寧,滕建文,黃 麗,韋保耀,董傳志

(廣西大學輕工與食品工程學院,廣西南寧 530004)

大米蛋白質(Rice protein,RP)是營養界所公認的優質植物蛋白,氨基酸組成合理、具有高生物價、低過敏性以及抗腫瘤活性等特性[1],近年來受到廣泛的關注與應用。大米蛋白質中含有不同類型的蛋白質,其中超過80%是谷蛋白,但由于大米蛋白質的溶解性等功能特性較差,在食品中的應用受到限制[2]。目前國內外對于提高蛋白質溶解性的改性方法主要集中在酶法、化學法、物理法和基因工程法,其中化學法改善蛋白質的功能特性較為顯著,常用的化學法有酸化、磷酸化、酯化、酰化和糖基化等[2-4]。其中糖基化改性由于反應可以自發進行的,無需要添加其他的化學物質,被認為是改善食品蛋白質功能特性的一種最為廣泛的方法。它可將糖類物質的親水基團以共價連接的方式接枝到蛋白質分子上,使修飾的糖基化產物一方面具有蛋白質的大分子特性,另一方面也具有糖類物質的親水特性,能有效的提高大米蛋白質的功能性質[5]。

目前,國內外文獻報道糖基化反應主要分為三個階段,即早期、中期和晚期,所有階段同時發生且相互關聯[6]。此外,糖基化反應的所有階段都受反應參數的影響,包括水分活度、反應溫度、反應時間、體系pH、蛋白與糖的組成、結構與性質等,其中使用的糖主要是葡萄糖與蔗糖等[7]。糖基化反應方法主要分為兩種,目前采用的糖基化方法主要包括干熱法和濕熱法。干熱法的反應條件比較溫和,產物功能特性較好,但是反應耗時長,反應條件較為嚴格;濕熱法由于反應體系中水分活度和加熱強度方面明顯高于干熱法,使得蛋白質分子和糖分子互相碰撞接觸的機會增加,有利于反應的進行[8]。而本文使用的水熱處理(HTC),又稱噴射蒸煮技術,能使蛋白質生成可溶性聚集體[9]。通常使難溶或不溶的物質溶解和重結晶[10]。目前,國內外研究表明可利用水熱技術提高蛋白質提取效率和改善蛋白質的功能特性[11]該技術已經有被應用到大豆蛋白糖基化的研究中,并且該技術相比于傳統的干法和濕法糖基化改性方法,耗時更短,反應進程更快,接枝度更高,并且高級階段產物更少[12],高級階段的終末產物(AGEs)在人體內累積會影響健康[13],但水熱技術在大米蛋白質與木糖糖基化改性的應用還未見報道。D-木糖是一種天然小分子還原糖,無毒,末端碳原子上的醛基易于與氨基發生美拉德反應,還能獲得較高抗氧化活性的糖基化反應產物[14]。

基于此,本試驗選擇大米蛋白質與木糖進行水熱糖基化處理(120 ℃),以期在促進大米蛋白質溶解性的基礎上,增加RP與木糖的接枝度,并對不同反應時間、pH、蛋白質與糖的質量比的條件下,水熱糖基化改性前后的大米蛋白質接枝度、結構及溶解性進行了初步的研究,以期為功能性大米糖蛋白的加工生產提供理論依據拓展大米蛋白的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米(珍桂米) 市售;木糖(≥99%) 北京索萊寶科技有限公司;鄰苯二甲醛(OPA) 源葉生物有限公司;酒石酸鉀鈉、四硼酸鈉(分析純) 天津市大茂化學試劑廠;氫氧化鈉、溴化鉀、鹽酸(分析純) 成都金山化學試劑有限公司;甲醇(分析純) 成都市科隆化學品有限公司;無水碳酸鈉(≥99.8%)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀(分析純) 天津博迪化工股份有限公司;Folin-酚、牛血清白蛋白、甘氨酸、SDS 北京索萊寶科技有限公司;β-巰基乙醇 Sigma-Aldrich公司。

手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;TLE204E分析天平、pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;TECAN酶標儀 上海勒菲生物科技有限公司;RW16電子攪拌機 德國 IKA 公司;ST-16R離心機 費默爾科技(中國)有限公司;S25磁力攪拌機 德國 IKA 公司;真空冷凍干燥機 德國CHRIST儀器有限公司;L-8900高速氨基酸分析儀 日本HITACHI公司;Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀 美國熱電公司;RF-5301PC熒光分光光度計、UV-1601紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水熱法制備RP-木糖糖基化產物 大米與正己烷按照1∶3 (w/V)采用索氏抽提法去除脂肪,30 ℃低溫烘干。稱取一定量脫脂大米與純水按質量比1∶10 (w/w)混合、浸泡、打漿,用2 mol/L NaOH調至pH10,室溫攪拌2 h后,4000 r/min離心20 min,取上清液,將上清液用2 mol/L HCl調至pH4.8 進行酸沉,4 ℃靜止24 h,經4000 r/min離心20 min,水洗沉淀,調至pH中性后進行透析、凍干。由凱氏定氮方法測得RP的蛋白質量分數為90%。

稱取一定量RP溶于濃度50 mmol/L 的磷酸緩沖液(pH11)至設定的蛋白質量濃度為1%,50 ℃下磁力攪拌30 min,經冷卻,在120 ℃的高溫蒸汽下,固定體系pH為8,木糖與RP質量比為5∶1,反應時間分別為10、15、20、25、30 min,固定反應時間為20 min,木糖與RP質量比為5∶1,調節體系pH為6、7、8、9、10,固定反應時間為20 min,體系pH為8,加入一定質量比的木糖(木糖∶RP=1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1),熱處理后,樣品冰浴冷卻備用,考察對接枝度和溶解度的影響。其余指標使用上清液凍干粉末(RP-木糖糖基化產物)分析。

1.2.2 接枝度測定 OPA試劑的配制:稱取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醇中,依次加入20% SDS溶液 2.5 mL,0.1 mol/L的硼砂溶液25 mL,100 μLβ-巰基乙醇,定容至50 mL。

樣品測定:吸取200 μL RP-木糖糖基化產物溶液加入所配試劑4 mL于試管中,混勻,于35 ℃水浴鍋中反應2 min,340 nm測其吸光值A1,相同條件下200 μL RP溶液吸光值為空白樣測定吸光值A0,二者之差ΔA為自由氨基的凈吸光值[15],通過OPA測定獲得反應前后的游離氨基酸含量的降低來表明糖基化反應的發生。

1.2.3 溶解度測定 采用福林(Folin)-酚試劑法測定上清液中溶解的蛋白質含量[16],凱氏定氮法測總蛋白質含量。

1.2.4 氨基酸分析 制備得到的RP和RP-木糖糖基化產物的氨基酸組成與含量,采用國標GB 5009.124-2016進行測定[17]。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 根據Laemmli[18]報道的方法,采用不連續緩沖系統進行電泳,分離膠濃度為12%,濃縮膠濃度為2%。分別稱取2 mg的RP和RP-木糖糖基化產物,加入500 μL電泳緩沖液,沸水煮5 min。上樣量10 μL,凝膠電泳于恒流下進行,樣品在濃縮膠中時電壓設定為80 V,進入分離膠后電壓調為120 V。電泳完成后凝膠采用考馬斯亮藍法(R-250)染色1 h,染色后于脫色液中脫色2 d,脫色完成后膠片拍照分析。

1.2.6 紫外光譜分析 RP和RP-木糖糖基化產物分散于pbs(pH7.0,50 mmol/L)緩沖溶液中,濃度為1 mg/mL。在紫外-可見分光光度計進行掃描,波長范圍:200～600 nm[19]。

1.2.7 熒光光譜分析 內源熒光光譜:RP和RP-木糖糖基化產物分散于50 mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)中,蛋白濃度為 0.2 mg/mL。取上清液3 mL,在掃描發射光譜為300～500 nm,激發波長290 nm,激發和發射狹縫寬均為5 nm[9],磷酸緩沖液的熒光光譜作為空白對照。

糖熒光光譜RP和RP-木糖糖基化產物分散于10 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中,蛋白濃度為1 mg/mL。取上清液3 mL,熒光光譜在334 nm激發,掃描發散光譜為350～550 nm,激發和發射狹縫寬均為5 nm,磷酸緩沖液的熒光光譜作為空白對照[9]。

1.2.8 紅外光譜分析 分別取1 mg RP,RP-木糖糖基化產物凍干樣品粉末,加入100 mg 溴化鉀,共混、研細、壓片,采用紅外光譜儀在4000～400 cm-1波數范圍內掃描[20]。

1.3 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 22進行數據處理,Oringin 8.6軟件作圖以及紅外數據處理,OMNIC軟件進行紅外數據處理,Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同反應時間對糖基化產物接枝度及溶解度的影響

從圖1可知,RP在沒有添加木糖的水熱作用下,溶解度均低于13%,這是由于在水熱情況下,蛋白發生熱變形,降低其表面親水性,使得溶解度一直處于較低水平[21]。但隨著反應時間的延長,有利于糖基化反應的進行,大米蛋白質與木糖發生糖基化反應,其接枝度和溶解度逐漸增加,反應20 min時達到最高值,分別為42.47%與26.07%,隨后均出現下降的趨勢。這可能與反應初期暴露在蛋白質表面的游離氨基可以較快的與木糖反應,引入糖基,增加蛋白的親水性質;但隨著加熱時間繼續增加,蛋白更多的內部氨基來參與反應,但此時已經糖基化的蛋白質有可能再次發生聚合,從而使接枝度與溶解度在20 min后略有降低[22-23]。

2.2 不同pH對糖基化產物接枝度及溶解度的影響

由圖2B看出,隨pH增大RP和RP-木糖糖基化產物溶解度增大,pH10時分別達到28.3%和35.5%,在pH8時溶解度由11.35%到27.1%增加了15.7%,增加值最大。可以看出pH對溶解度的影響>接枝度對溶解性的影響,但在食品加工以及保存過程中,極少使其pH高于8。

圖2 不同pH對糖基化產物接枝度(A)及溶解度(B)的影響Fig.2 Effect of different pH on grafting degree(A)and solubility(B)

pH6～8接枝度隨pH增加增加,這是因為,在酸性條件下氨基是離子化的銨離子,反應活性低,并且在酸性條件下蛋白的溶解度本身也比較低,當pH8時達到最大41.94%,pH為9時接枝度有所下降,pH10時接枝度又開始上升。糖基化反應本質上是堿催化反應,因此pH偏向堿性有利于反應的進行。但是堿性過強,蛋白質的一級結構可能發生變化,如脫氨脫羧和肽鍵斷裂,引起的“胱賴反應”將氨基酸轉化為有毒的化合物,反而不利于接枝反應的進行[24]。

2.3 木糖與RP不同質量比對糖基化產物接枝度及溶解度的影響

由圖3,隨著木糖質量比的增加溶解度和接枝度都是呈現先上升至最大值后下降的趨勢,接枝度與溶解度成正比,木糖與RP質量比為7∶1時溶解度到達最大27.62%,此時接枝度也達到最大值46.50%。這由于RP與木糖的比例在達到最佳值之后,如果繼續增加木糖的量那么會使溶液的黏度上升,從而使得分子的流動性變差[25-26]。與此同時,由于大分子的空間穩定作用,使得反應位點不容易靠近,所以接枝度在上升達到最高值后反而呈現下降的趨勢。

圖3 木糖與RP不同質量比對糖基化產物接枝度(A)及溶解度(B)的影響Fig.3 Effect of different ratios of xylose and protein on grafting(A)degree and solubility(B)

通過對水熱反應的時間、溫度、pH及木糖與RP質量比的研究中,以接枝度為評判指標,得出RP與木糖的較優的反應條件為:水熱溫度120 ℃,水熱時間為20 min,pH為8,木糖與蛋白質量比為7∶1,接枝度達到最大46.50%,RP-木糖糖基化產物溶解度達到27.62%是RP的2.38倍,在此條件下制備糖基化產物,并進一步分析產物的結構變化。

2.4 氨基酸組成分析

對RP、RP-木糖糖基化產物進行氨基酸分析,結果見表1。通過對氨基酸含量進行分析,大米蛋白質中主要的氨基酸為谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)與亮氨酸(Leu)。在糖基化反應過程中,大米蛋白質氨基酸中主要是賴氨酸和精氨酸的相對含量減少,分別從6.04與7.66降低到2.99與5.77,這是由于賴氨酸和精氨酸的側鏈上存在自由氨基,參與了RP和木糖的糖基化反應。在表中也同時發現,酪氨酸、半胱氨酸與甲硫氨酸的相對含量也有較為明顯的降低,這表明半胱氨酸也參與到接枝反應中,含量降低的原因則可能是由于其側鏈中存在硫醇和羥基,其可與糖分子發生反應[27]。

表1 RP、RP-木糖糖基化產物的氨基酸的組成(g/100 g氨基酸)Table 1 Amino acid compositions of RP,RP-xylose(g/100 g amino acid)

2.5 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE是判斷蛋白中以共價鍵結合糖的重要手段,也可以驗證添加木糖對大米蛋白質的結構及組成產生的變化,對RP及RP-木糖糖基化產物的反應產物進行考馬斯亮藍染色,其還原與非還原條件下的電泳圖譜如圖4所示。從圖中可以看出RP(1)的主要成分為谷蛋白,其中包括相對分子量為51 kDa的谷蛋白聚肽、34～37 kDa與21～22 kDa的谷蛋白酸性亞基和堿性亞基以及26 kDa的球蛋白亞基[28]。在還原條件下,經過β-巰基乙醇處理后,濃縮膠頂部高分子量的蛋白聚集體以及大部分谷蛋白聚肽會被還原成小分子量的肽,所以RP對應的谷蛋白的酸性亞基與堿性亞基條帶的光密度明顯增強,這與RP中的二硫鍵的斷裂有關。而在非還原條件下RP(泳道3)在濃縮膠頂部富含以共價的二硫鍵結合的高分子量的蛋白聚集體、分離膠上有谷蛋白聚肽、球蛋白、谷蛋白酸性亞基及谷蛋白堿性亞基的形式[29],且谷蛋白聚肽的含量明顯高于還原條件下的含量。RP-木糖(泳道2與泳道4)糖基化產物在還原和非還原條件下都顯示出比較連續的條帶特征,缺乏明顯的谷蛋白聚肽、球蛋白亞基和谷蛋白堿性亞基,說明這些亞基有可能參與到與木糖的糖基化反應中,生成分子量較大的結合物,在濃縮膠頂部顯示出大量聚集體,與RP在β-巰基乙醇的作用下聚集體幾乎降解不同,這種聚集體在β-巰基乙醇的作用下的還原電泳條帶中,較難發生分解(泳道2),這說明RP與木糖發生糖基化反應生成了不同的RP-木糖高分子量聚集體[30-31]。

圖4 RP與RP-木糖糖基化產物的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE mapping of RP and RP-xylose注:其中泳道1、泳道2為還原條件下RP、RP-木糖糖基化產物;泳道3、泳道4為非還原條件下RP、RP-木糖糖基化產物;Maker為標準蛋白質。

2.6 紫外光譜分析

從圖5可知,由于RP中的芳香族氨基酸酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)以及苯丙氨酸(Phe)殘基在225與280 nm波長下也能吸收一定波長的紫外光[32],同時糖基化產物羥甲基糠醛在280 nm附近也有紫外吸收[33]。但是添加木糖進行糖基化反應后,這兩個最大吸收峰沒有明顯的紅移或藍移,說明蛋白肽鏈中的酪氨酸和色氨酸微環境極性沒有明顯改變[12],而水熱糖基化后的RP-木糖在280 nm附近的紫外吸收值明顯高于RP的紫外吸收[34]。這可能是由于水熱糖基化使蛋白質的構象發生了變化,疏水基團暴露而使芳香族氨基酸的紫外吸收增大,結合氨基酸分析表1可知,酪氨酸(Tyr)的含量下降,苯丙氨酸(Phe)的含量增加,但增加量只有0.89%;同時糖基化產物的產生也是一個重要原因,說明糖基化產物羥甲基糠醛是導致紫外吸收增加的主要物質[33]。在280～320 nm之間新增了一個吸收峰,這可能是糖基化反應的過程中,一方面糖會發生異構和脫水,產生糠醛類物質,在 290 nm 左右有特征吸收;另一方面,用木糖糖基化修飾RP,生成了一些糖基化高級階段產物,并在290 nm左右形成了具有顯著吸光特性的生色團,增加了吸光值,這是美拉德反應的特征[35]。

圖5 RP與RP-木糖糖基化產物的紫外光譜Fig.5 UV spectrum of RP and RP-xylose

2.7 熒光光譜分析

在290 nm的激發波長下,色氨酸為發射基團的熒光光譜,通過對蛋白中的色氨酸微環境的極性改變來反映蛋白質構象變化[36]。通常,如果色氨酸最大熒光發射峰(λmax)<330 nm,則色氨酸被指定為埋藏在“非極性”環境中;如果λmax>330 nm,則色氨酸被指定為處于“極性”環境中[37],因此,從圖6可見,本研究中的RP的色氨酸基團存在于“極性”環境中,而隨著木糖的加入,RP-木糖的熒光發射峰的峰形保持不變,但是熒光發射強度發生猝滅,這可能是由于糖鏈的產生對蛋白造成屏蔽效果[30]。此外,RP-木糖糖基化產物的λmax從351 nm增加到362 nm,發生了紅移,熒光波長紅移及熒光強度淬滅結果表明木糖和大米蛋白質分子之間可能發生了相互作用。當最大熒光發射波長發生紅移,表明蛋白內部的色氨酸發射基團位于更為親水的微環境中[38],這可能與RP-木糖在水熱糖基化過程中,一方面由于受到高溫高濕條件的影響,原來在熱穩定過程中以二硫鍵形成的緊密的蛋白聚集體分子展開,暴露出更多的親水基團[9],另一方面由于糖分子的中的羥基作為極性基團的引入。

圖6 RP和RP-木糖糖基化產物熒光掃描圖譜Fig.6 Fluorescence spectrum of complexes of RP and RP-xylose

蛋白質與糖發生糖基化反應會生成有色物質,而熒光物質是有色物質的前體物[39],采用334 nm作為激發波長,通過對糖基化反應產物的熒光強度與熒光光譜掃描來判斷糖基化反應的強度[9],得到圖7所示的糖熒光光譜掃描圖,RP-木糖在419 nm處有最大熒光強度,RP在此波長下沒有熒光發射峰,由此推斷糖基化反應的發生,以及有色物質形成可能是由于低分子量化合物的形成和高分子量類黑精的存在[39]。

圖7 RP和RP-木糖糖基化產物糖熒光掃描圖譜Fig.7 Fluorescence spectrum of complexes of RP and RP-xylose

2.8 紅外光譜分析

紅外光譜是一種常用的分析蛋白質結構的方法,能夠通過蛋白在中紅外區有若干特征吸收峰,靈敏地反映出肽鏈結構的變化[40]。圖8是RP和RP-木糖糖基化產物的紅外光譜圖,從圖可以發現RP-木糖糖基化產物在3700～3200 cm-1波長范圍內光譜強度增強(即透光率下降),由于此波長范圍內主要是由于游離-OH 的伸縮振動引起透過率的減少,這表明 RP發生糖基化反應后,糖分子以共價鍵形式接入RP中,使-OH的數量增多[20]。蛋白質的紅外光譜圖譜有幾組特征吸收譜帶:酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶,其波長分別對應于1600～1700、1530～1550 cm-1波數范圍[41],紅外光譜測定的酰胺Ⅰ帶里可以計算二級結構含量,取酰胺Ⅰ帶的范圍進行計算,進行二階導數處理,并運用高斯擬合,各二級結構的峰面積與酰胺Ⅰ帶總峰面積的比值為二級結構的含量見表2。其中特征吸收譜帶酰胺Ⅰ帶(主要C=O為伸縮振動)能夠反映蛋白質二級結構(包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲等)的變化,其中α-螺旋主要表現在1650～1 660 cm-1、β-折疊在1618～1640和1670～1690 cm-1、β-轉角在1660～1670和1690～1700 cm-1、無規則卷曲結構在1640～1650 cm-1區域內[42-43]。因此,表2中RP-木糖與RP相比,α-螺旋和β-折疊有顯著降低分別降低了2.15%和3.14%,α-螺旋主要在RP分子的內部,含量的減少說明蛋白質分子間氫鍵被破壞,使得蛋白中的游離氨基與糖類發生-接枝反應[42-43]。無規則卷曲含量顯著增加,從8.74%到18.14%,說明部分α-螺旋和β-折疊轉化為了無規則卷曲,β-轉角無明顯變化,進一步說明水熱糖基化后的RP的結構更加松散[44]。由圖8,酰胺譜Ⅱ帶能靈敏地反映分子間或分子內的氫鍵締合作用,水熱糖基化反應破壞了這些為蛋白分子提供穩定性的作用力,使蛋白質結構更為靈活[45]。1000～1070 cm-1吸收峰是糖分子中C-O-C官能團的伸縮振動和糖環存在的典型特征[46],從圖中也可以看出RP-木糖糖基化產物的紅外光譜在1050 cm-1吸收峰處明顯的吸收強度,表明木糖分子與RP發生了糖基化反應,引入了相應的功能性基團,導致蛋白分子側鏈振動[20]。

表2 RP與RP-木糖糖基化產物的二級結構組成Table 2 Secondary structural contents of RP and RP-xylose

圖8 RP與 RP-木糖糖基化產物的FIIR圖Fig.8 FTIR spectra of RP and RP-xylose

3 結論

通過研究水熱糖基化改性對大米蛋白質的結構及溶解性的影響,得到結論當反應溫度為120 ℃,反應時間20 min,pH8,木糖與RP質量比7∶1時,接枝度達到最大46.50%,RP-木糖糖基化產物溶解度是RP的2.38倍,水熱糖基化反應生成的RP-木糖糖基化產物相比于RP的溶解性質得到部分改善。參與RP和木糖水熱糖基化反應的主要氨基酸為精氨酸和賴氨酸,并且溶解度的改善與RP和木糖的共價結合密切相關;且亞基結構中谷蛋白聚肽、球蛋白亞基和谷蛋白堿性亞基可能參與到與木糖的糖基化反應中,生成了RP-木糖高分子量聚集體;此外,二級結構中α-螺旋和β-折疊結構減少、無規則卷曲增加,這可能與熱引起的氫鍵的締合作用發生改變相關。由于改性后RP的溶解性仍然較低,且在糖基化過程中還有可能會產生糖基化的高級階段產物有害的AGEs,因此,需要對繼續采用合適的糖基化反應來改善溶解性和其他功能性質,并對糖基化中可能產生的有害產物的控制進行進一步的研究。