活性氧在果實成熟和衰老中的作用及調控機制

李秋雨，曾凱芳，姚世響*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學 食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

1 活性氧在植物生長發(fā)育和抗逆中的作用

ROS在植物抗逆過程中具有重要調控功能[2]。植物激素脫落酸(abscisic acid, ABA)是誘導植物抗旱的主要激素，通過誘導氣孔關閉、減少水分散失實現(xiàn)抗旱。ROS是ABA誘導氣孔關閉過程中激活Ca2+通道的關鍵分子，當擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶編碼基因AtGPX3突變后，ABA不能激活Ca2+通道，也無法誘導氣孔關閉[9]。鹽脅迫是作物面臨的主要非生物脅迫之一，研究發(fā)現(xiàn)ROS激活的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)途徑參與了水稻對鹽脅迫的早期響應，其中轉錄因子SERF1起關鍵功能[9]；乙烯應答關鍵轉錄因子EIN3通過抑制ROS積累介導乙烯對植物耐鹽性的誘導[11]。低溫是植物經(jīng)常面臨的逆境，研究證實ROS信號也參與了植物響應低溫的信號轉導途徑[12]。細胞在面臨逆境時，細胞器通常是最敏感的部位，易受逆境傷害；因此細胞器感應逆境信號并快速啟動應答，對植物適應逆境至關重要[13]；近期研究揭示,ROS參與了葉綠體逆向信號通路，葉綠體在逆境積累的過量ROS特異性激活蛋白激酶GCN2，磷酸化定位于細胞質的翻譯起始因子eIF2，在翻譯水平調控細胞核基因的表達[14]。證據(jù)目前已經(jīng)充分證實,ROS不僅參與多種逆境的信號通路，還可能是生長發(fā)育和抗逆兩大類信號通路對話的關鍵信號分子，在植物整合生長發(fā)育和逆境脅迫，適應不同生長發(fā)育階段和復雜環(huán)境過程中起重要作用[2]。

2 活性氧在果實成熟及衰老過程中的動態(tài)變化

ROS含量在果實成熟和衰老階段呈總體升高的動態(tài)變化特征，通常在成熟啟動時急劇上升，達到第1個峰值并在成熟后期開始回落，果實衰老階段又逐漸升高，出現(xiàn)第2個峰值后再下降[13, 15]。

綜上，ROS含量在果實成熟和衰老過程中先后出現(xiàn)2個高峰；第1個高峰與ROS生成系統(tǒng)活性提高密切相關，可能在果實成熟調控過程扮演重要功能；第2個高峰可能是ROS生成系統(tǒng)活性提高和抗氧化系統(tǒng)活性降低共同作用所致，參與誘導了果實衰老。

3 活性氧參與調控了果實成熟與衰老

活性氧參與了果實成熟與衰老的調控過程，主要有以下幾方面證據(jù):首先，如上文所述，果實成熟衰老與ROS含量呈正相關；其次，對果實成熟階段基因表達豐度進行系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)，成熟早期活性氧代謝相關基因表達量非常高[35]，表明ROS可能參與調控了果實成熟；另外，用活性氧處理果實會加速衰老，如H2O2處理龍眼果實加劇了采后衰老和褐變產(chǎn)生，顯示ROS具有誘導果實衰老的功能[36]；此外，用抗氧化劑處理果實，能夠有效抑制衰老并延長采后壽命，如AsA處理番茄果實能夠延長貨架期，進一步證實ROS具有調控果實衰老的功能[16]；研究還發(fā)現(xiàn)褪黑素處理可以促進葡萄果實成熟，并且這種誘導作用可能是通過ROS實現(xiàn)的，當用NADPH氧化酶抑制劑二苯基氯化碘鹽(diphenyleneiodonium chloride, DPI)處理葡萄果實時，褪黑素對果實成熟的誘導作用受到抑制，DPI處理葡萄抑制了果實內源ROS的合成，進而阻礙了褪黑素對果實成熟的誘導作用，這證明褪黑素對果實成熟的調控依賴于ROS[37]。氣調貯藏是果蔬保鮮行業(yè)常用的、延緩果實采后衰老的有效措施，有學者對獼猴桃的研究表明，氣調貯藏可通過抑制ROS的積累延長采后壽命并提高貯藏品質[28]。

目前有遺傳證據(jù)支持ROS可能調控了果實的成熟與衰老。線粒體抗壞血酸合成關鍵酶L-半乳糖酸-1,4-內酯脫氫酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase, GalLDH)編碼基因突變后，線粒體氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，果實變小[38]；番茄單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase, MDHAR)編碼基因沉默后，果實還原型AsA含量顯著增加，果實單重變小，采后失重率顯著提高[39]。盡管抗壞血酸狀態(tài)的改變與果實成熟與衰老的關系在這2例研究中涉及較少，但可以發(fā)現(xiàn)ROS穩(wěn)態(tài)的改變影響了果實發(fā)育。番茄果實中的進一步研究顯示,ROS具有調控果實成熟與衰老的功能。在番茄果實中過表達酵母亞精胺合酶，提高了果實多胺水平和抗氧化能力，降低了果實內部ROS水平，并有效抑制了果實衰老和延長了果實采后壽命[40]；在番茄果實中特異性表達花青素合成相關轉錄因子，能夠顯著提高果實中花青素含量，提高了抗氧化系統(tǒng)活性，降低了內源ROS水平，最終有效抑制了果實采后衰老[41]。對不同品種的番茄果實進行比較分析后，發(fā)現(xiàn)抗氧化能力越強的品種采后壽命越長[42]。

4 活性氧調控果實成熟與衰老的分子機制

TIAN等[15]明確提出ROS是誘導果實成熟與衰老的因子，并從線粒體角度闡述了其調控機制。果實成熟與衰老過程中，面臨ROS水平升高產(chǎn)生的氧化脅迫，其中包括線粒體和葉綠體在內的細胞器是感受脅迫的第一道防線，對氧化傷害非常敏感[43]。Porin蛋白是線粒體滲透轉換氣體復合體亞基，定位于線粒體外膜，被ROS進行羰基化修飾后，會嚴重影響線粒體正常功能；同時ROS誘導的羰基化嚴重降低了線粒體SOD、順烏頭酸酶和蘋果酸脫氫酶等活性，抑制了三羧酸循環(huán)和呼吸途徑作用，導致細胞ATP合成能力減弱，改變了細胞能量狀態(tài)，最終誘發(fā)果實衰老[15, 44]。

植物激素和轉錄因子是調控果實成熟與衰老的關鍵因子，ROS可能參與這些關鍵因子的下游或者與其協(xié)同發(fā)揮功能[15]。研究揭示,ROS平衡參與轉錄因子調控果實衰老的信號通路，交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)是維持線粒體ROS水平的關鍵酶，調控荔枝果實衰老的重要轉錄因子LcNAC1通過與LcWRKY1相互作用，拮抗調控LcAOX1a轉錄水平，最終影響果實ROS水平，實現(xiàn)對果實衰老的調控[45]。

果實成熟與衰老時，線粒體和葉綠體(或有色體)是ROS產(chǎn)生的重要細胞器，也極易受到氧化傷害[46]。近年模式植物的研究揭示了細胞器逆向信號轉導機制，如細胞器ROS通過MAPK3和MAPK6激活MAPK信號級聯(lián)途徑，調控細胞核基因轉錄[13]。另外，葉綠體產(chǎn)生的ROS可特異性激活蛋白激酶GCN2，通過磷酸化位于細胞質的翻譯起始因子eIF2，進而在翻譯水平調控基因表達[14]。最后，ROS還可能影響包括乙烯、赤霉素和茉莉素在內的植物激素合成[13]，影響果實的成熟與衰老。迄今為止，尚無直接證據(jù)表明ROS逆向信號通路調控了果實成熟與衰老。

果實ROS含量在成熟與衰老階段呈現(xiàn)規(guī)律性的變化特征，這種ROS穩(wěn)態(tài)的動態(tài)變化由ROS生成系統(tǒng)和降解系統(tǒng)維持。果實成熟與衰老過程中，面臨復雜的生長和貯藏條件，因此需要感受ROS濃度的受體，能迅速感知細胞ROS濃度的變化，一方面將信號傳遞給ROS代謝系統(tǒng)以對ROS濃度進行精準調控，另一方面啟動ROS信號傳導途徑，參與果實成熟和衰老的調控。ROS受體在ROS信號通路中有關鍵地位，科學家近20年花費了大量精力鑒定植物ROS受體[9, 47]，最近終于有了突破性進展，裴真明課題組成功鑒定了擬南芥質外體ROS受體HPCA1，該蛋白是位于細胞質膜的受體蛋白激酶家族成員，HPCA1突變后，ROS不能誘導細胞內Ca2+濃度增加，進而影響其相應調控功能的發(fā)揮[48]。考慮到ROS在植物生長發(fā)育和抗逆中扮演保守且廣泛的功能，因此果實中可能存在HPCA1的功能同源蛋白，在感受ROS并調控果實成熟與衰老中發(fā)揮功能。

5 活性氧穩(wěn)態(tài)調控技術在延緩果實成熟及衰老中的應用

果實的活性氧穩(wěn)態(tài)受到ROS生成系統(tǒng)和ROS清除系統(tǒng)的協(xié)同調控，保障其發(fā)揮正常的生理調控功能。果實采后保鮮產(chǎn)業(yè)希望能夠操控果實的成熟與衰老進程，抑制果實衰老對延長果實貯藏壽命、維持采后品質十分關鍵。通過調控果實ROS穩(wěn)態(tài)，能夠改變果實的成熟與衰老進程，在果實采后保鮮領域具有良好的應用前景。

現(xiàn)代生物技術備受學術界關注和果蔬采后保鮮產(chǎn)業(yè)青睞，通過基因工程技術可穩(wěn)定提高果實內源抗氧化系統(tǒng)活性，是延緩果實衰老、保持果實采后品質的高效技術。在番茄果實過表達酵母亞精胺合酶編碼基因，提高了果實多胺含量和抗氧化水平，有效抑制了果實衰老[40]。金魚草轉錄因子Delila和Rosea1是控制花青素合成的關鍵基因，在番茄過表達后顯著提高了果實花青素含量和抗氧化活性，抑制了果實衰老，采后貯藏壽命增加1倍[41]。通過比較不同轉基因番茄株系的果實，發(fā)現(xiàn)具有較強抗氧化活性的黃酮含量越多，果實采后壽命越長，進一步顯示通過基因工程技術改變果實ROS穩(wěn)態(tài)，是延緩果實采后衰老的有效辦法[42]。

除了基因工程技術，對果實進行可調控ROS穩(wěn)態(tài)的采后處理，也是延緩果實衰老的有效策略。對采后果實進行活性氧處理能夠促進衰老，進行抗氧化劑處理則能延緩果實衰老，如H2O2處理能促進龍眼衰老，AsA處理延緩番茄衰老[16, 36]。另外，褪黑素處理采后荔枝[30]和桃[27]、對獼猴桃氣調貯藏[28]、1-MCP處理梨[25]、采后硒處理番茄[29]、對木瓜進行采后熱處理[49]、對黃瓜進行采后冷激處理[32]、沒食子酸丙酯處理采后龍眼[26]、殼聚糖/納米硅復合涂膜劑處理枇杷[33]等可能主要是通過改變果實ROS穩(wěn)態(tài)，即激活ROS清除系統(tǒng)，降低組織ROS含量，達到延緩衰老和改善果實品質目的。另外，水楊酸處理杏果實可以通過抑制ROS清除系統(tǒng)，提高ROS含量，實現(xiàn)延緩果實成熟和采后品質劣變的目的[50]。

6 結論

活性氧是調控果實成熟與衰老的重要因子，其含量在果實成熟與衰老階段呈動態(tài)變化特征。基于調控果實ROS穩(wěn)態(tài)的包括基因工程技術和采后處理在內的各項技術在果實采后保鮮產(chǎn)業(yè)有良好的應用前景，可以用于延緩果實成熟與衰老，改善采后品質，延長貯藏壽命。目前ROS調控果實成熟與衰老機制領域還有許多重要問題亟待解決：一是需要摸索合適實驗條件，以番茄等研究水果的模式植物為材料，鑒定果實ROS穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變的突變體，這對明確果實ROS生成位置、條件和濃度，及其與果實成熟與衰老的關系非常重要；二是果實成熟與衰老過程中ROS穩(wěn)態(tài)如何被精準調控，是否存在ROS受體，相應分子機制是什么等重要問題仍處于未知狀態(tài)；三是ROS逆向信號轉導如何調控果實成熟與衰老，線粒體和葉綠體等細胞器產(chǎn)生的ROS如何影響細胞核基因表達。通過對這些問題的研究，不僅可以闡明果實成熟與衰老的分子機制，同時也有助于理解生物衰老過程中ROS發(fā)揮作用的普遍機制。另外，通過對ROS調控果實成熟與衰老的基礎研究，也為果實生物學和采后生物學相關應用技術開發(fā)奠定理論基礎。