食源性致病菌快速檢測研究進展

孫穎穎，董鵬程，朱立賢，張一敏，羅欣，毛衍偉

(山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

隨著社會經濟的發展和人們生活水平的改善，食品安全問題越來越得到人們的重視，但食源性疾病依然在各個國家廣泛爆發并導致嚴重后果[1]。造成人類食源性疾病的主要致病菌有大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、空腸彎曲菌和弧菌等[2-3]，其中檢出率最高的是沙門氏菌，其次是志賀氏菌，之后分別為金黃色葡萄球菌、致瀉性大腸埃希菌和蠟樣芽孢桿菌[4]等。食品中富含各種營養物質，是致病菌生長繁殖的良好基質，在加工、包裝、配送和儲存等過程中極易受到致病菌污染。消費者食用了含有致病菌的食物，會出現嘔吐、腹瀉等癥狀甚至導致死亡[5]。因此，食源性致病菌的檢測對于保障消費者安全至關重要。

食源性致病菌的鑒定、檢測方法有很多。其中傳統的方法是平板菌落計數法，然而這種方法勞動強度大且耗時長，往往需要7～10 d才能得到最終結果，無法滿足快速、原位檢測致病菌的需求。此外還有基于免疫學的方法(抗原抗體相互作用)、循環介導等溫擴增和三磷酸腺苷生物發光法(adenosine triphosphate bioluminescence, ATP)生物發光技術等，盡管這些方法靈敏并且可以同時檢測一種或多種微生物，但普遍存在耗時費力等缺點。因此，為了確保食品安全，防止食源性疾病傳播，迫切需要快速、準確的食源性致病菌檢測方法。

隨著納米材料的快速發展，電子、光學和電化學等科學的不斷進步，目前人們已探究并建立了各種新穎的檢測分析方法，如微流體法[6]、流式細胞術、基于核酸的分析方法[7]、生物傳感器、電子鼻和電子舌[8]、光譜成像技術[9]等，都適合食源性致病菌的快速檢測。通過對上述各種技術的對比分析，本文綜述了適合快速檢測最有潛力的3種方法：振動光譜學技術、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)和生物傳感器。本文在簡介了相關背景和技術原理后，詳細分析討論了其在食源性致病菌快速檢測中的應用，為食源性致病菌檢測方法的研究和食品產業的應用選擇提供參考。

1 振動光譜學技術

在致病菌的檢測方法中，振動光譜技術具有快速、無損、可以實時在線檢測并且樣品制備簡單的優點，在食品產業中的應用最具前景和吸引力。近年來，拉曼光譜和近紅外光譜技術在致病菌的定量和定性檢測中顯示出巨大潛力。細菌的不同菌種和菌株的振動光譜具有極大的相似性，但由于不同菌種或菌株間的生化成分和含量往往存在差異，因此需要結合化學計量法，例如層次聚類分析(hierarchical Cclustering analysis，HCA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)、人工神經網絡和支持向量機(support vector machine, SVM)等，可以對同種或多種致病菌進行分類和鑒別。

1.1 拉曼光譜技術

拉曼光譜屬于振動光譜技術。單色光和振動分子間相互作用時可以產生彈性碰撞和非彈性碰撞。光子與振動分子的彈性碰撞產生的散射稱為“瑞利散射”；在光子與振動分子的非彈性碰撞中，能量要么從光子轉移到分子，產生“斯托克斯拉曼散射”；要么從分子轉移到光子產生“反斯托克斯拉曼散射”。由于“斯托克斯拉曼散射”比“反斯托克斯拉曼散射”更為強烈，因此“斯托克斯拉曼散射”被用于傳統的拉曼光譜。拉曼光譜可以對食品中的致病菌進行快速、無損的實時原位檢測，作為傳統致病菌檢測方法和分子生物學方法的補充。拉曼光譜結合適當的光譜預處理和化學計量法，能夠提供完整細胞和組織內部的物質濃度、結構以及相互作用的信息，因此，拉曼光譜可以獲取單個細菌細胞的成分信息，對污染食源性致病菌的食品基質進行檢測，還可以對不同菌屬以及同一菌屬不同血清型的致病菌進行區分鑒定[10]。

眾多研究表明，拉曼光譜可以在單細胞水平上用最少的樣品來檢測致病菌。ASSAF等[11]將拉曼光譜掃描引入到檢測沙門氏菌的ISO(6 579:2 002)標準中的3種不同途徑，檢測時選擇在指數生長期的沙門氏菌，以提高對于近緣菌種的鑒別區分能力。結合PCA結果顯示，拉曼光譜鑒定沙門氏菌的相關系數(R2)為0.985，檢測時間從100 h減少到50 h，表明ISO(6579:2002)結合拉曼光譜技術大大縮短了檢測時間，提高了準確性。MEISEL等[12]建立了基于拉曼光譜的三級分類SVM模型，從人工污染的碎牛肉和雞胸肉中分離出單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和小腸結腸耶爾森菌，對革蘭氏水平、屬水平和種水平的分類模型實現了90.6%～99.5%的準確性，實現了對低濃度致病菌污染的快速檢測，避免了耗時的預濃縮步驟。

為了增強拉曼光譜的信號、減少干擾，科研人員開發了表面增強拉曼散射(surface-enhanced raman scattering，SERS)技術。SERS是一種特殊的拉曼光譜技術，通常使用硬幣金屬，特別是金或者銀作為SERS的底物，通過小金屬顆粒或粗糙金屬表面與目標分子的相互作用使光譜信號強度比普通拉曼光譜提高了7個數量級[13-14]。SERS的應用提高了拉曼光譜在食源性致病菌檢測中的分析能力。LIU等[15]使用種子介導法合成金納米粒子作為SERS的增強底物，掃描雞胸肉中分離出的4種假單胞菌，得到的SERS光譜結合PCA和HCA對4種假單胞菌進行鑒別，結果顯示，它們的遺傳關系與16S rRNA的結果完全一致，分類準確率高達100%，實現了快速、準確檢測。LUO等[16]使用膠體銀作為SERS的底物對2種單增李斯特菌、伊諾特氏李斯特菌、大腸桿菌O157：H7和鼠傷寒氏沙門氏菌進行拉曼光譜分析，結果表明，膠體銀可有效增強拉曼光譜信號，并對4種食源性致病菌進行準確鑒定。此外，有人使用SERS結合免疫分析法準確檢測到了低濃度病毒，SERS的使用大大縮短了檢測時間。KOGLER等[17]以納米金為SERS的底物，成功鑒別了大腸桿菌和單增李斯特菌。

1.2 紅外光譜技術

紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)區域覆蓋電磁波中12 500～33 cm-1的頻率，可分為近紅外(12 500～4 000 cm-1)、中紅外(4 000～400 cm-1)和遠紅外(400～33 cm-1)區域，其中，近紅外和中紅外區域常用于化學分析，并用于致病菌檢測。微生物的細胞膜和細胞壁具有獨特的化學成分，如核酸、蛋白質、碳水化合物和脂肪酸等，可以提供獨特的紅外吸收光譜。雖然大多數微生物的化學成分略有不同，但仍具有相似的紅外光譜。因此，IR技術也需要與光譜預處理和化學計量法相結合，才能用于致病菌的定量和不同菌種之間的分類[18]。

基于細胞成分的紅外吸收技術，可在菌種、亞種、菌株、血清型和單倍體水平上對各種致病菌進行鑒別和分類。DAVIS等[19]研究表明,紅外光譜結合HCA和典型變量分析可在單倍體、血清型和菌株水平上鑒別單核增生李斯特菌，其鑒別準確率分別為91.7%、96.6%和100%，所有的分類都可在18 h內完成。ERNEST等[20]使用可見近紅外高光譜成像技術結合判別分析和支持向量機模型將大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌分類鑒別，判別分析和支持向量機的預測準確率均較高，分別為90.7%和82.2%，結果證明該方法可以準確、快速識別和鑒定食源性致病菌。TITO等[21]使用近紅外光譜結合PCA和偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)預測大西洋鮭魚中的腐敗菌落數量，相關系數(R2)為0.95，標準誤差(root mean squared error，RMSE)為0.12 lg CFU/g，該方法建立的預測模型可較好地運用到食源性致病菌的近紅外光譜檢測中。然而，上述研究多使用昂貴、大體積的臺式儀器進行，在實際應用中的適應性較差。DUAN等[22]利用便攜式近紅外光譜儀檢測牙鲆魚片中的菌落總數，通過將遺傳算法(genetic algorithm，GA)和反向傳播人工神經網絡(back propagation artificial neural network，BP-ANN)算法與600～1 100 nm的紅外光譜結合，建立了預測模型，結果具有良好的預測準確度(R2=0.985, RMSE=0.095)。應用便攜式設備有利于方便應用，值得進一步研究并建立檢測方法。

以振動光譜學為基礎檢測食源性致病菌的例子如表1所示。

表1 用于食源性致病菌檢測的振動光譜學技術Table 1 Vibration spectroscopy techniques for detection of foodborne pathogens

2 PCR

PCR是1986年發展起來的一種體外擴增DNA的方法[25]，具有分析時間短、特異性高和自動化的優點，是食品中常見的致病菌檢測方法之一[26]。許多使用PCR檢測食源性致病菌基因和基因組區域的方法已被開發出來，并應用于食源性致病菌檢測。由于食物成分通常會干擾酶反應，所以食物樣本在PCR前需要預處理，通過離心或磁分離技術分離或濃縮病原體，然后從濃縮的細胞中提取DNA作為PCR的模板，以提高PCR檢測的靈敏度和準確性。GORDILLO等[27]使用免疫磁分離技術篩選肉制品中的大腸桿菌O157:H7，富集后使用PCR檢測大腸桿菌的基因型，檢測限(limit of detection，LOD)為103CFU/mL。TAYLOR等[28]使用雙強度氧化鈦氫氧化物對碎牛肉中的大腸桿菌O157:H7進行富集，之后提取DNA并進行PCR檢測，得到LOD為103CFU/mL，做到了對低濃度大腸桿菌O157:H7的檢測，省去了耗時的富集等預處理步驟。

2.1 多重PCR

多重PCR(multiplex PCR，mPCR)是一種應用廣泛的分子診斷技術，該技術在單次PCR實驗中使用2組或2組以上引物對不同的目標基因序列進行擴增，每組引物都能夠檢測1個基因、1個基因變體或1個特定生物體的基因組標記[29]。自1988年實施以來，mPCR被廣泛用于食源性致病菌的檢測。WEI等[2]以rfbE、nuc和invA基因為靶點設計引物，鑒定大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，檢測靈敏度為103CFU/mL，與單重PCR的檢測結果一致，可見mPCR是一種簡便易行而又快速的檢測方法。GORDILLO等[27]在免疫磁分離和選擇性富集之后，使用mPCR檢測大腸桿菌O157:H7基因型，結果顯示,不同引物對相對應的基因型有極高的特異性，實現了高效快速檢測。還有學者用mPCR在未富集的情況下，對牛奶和雞肉中的金黃色葡萄球菌、阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌O157:H7、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌和沙門氏菌6種致病菌進行擴增檢測，所有6種病原體均被檢出，LOD為103～104CFU/mL，在進行富集之后，將2種多重PCR結合，LOD則低至100CFU/mL，且僅用了10 h就得到結果[30]。

盡管mPCR技術是一種檢測食源性致病菌的可靠方法，但由于mPCR在一次反應中需要擴增多個基因序列，因此所有的引物要在相同的溫度下退火才有效。另外，引物之間可能會相互作用，導致引物二聚體或者不需要的目標序列擴增，對實驗結果產生干擾，因此，分析前要確定每個引物的合理濃度。

2.2 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測是向反應體系中加入熒光基團，通過連續監測PCR指數擴增期間熒光信號的強弱變化，實時監測特異性產物的量，最后通過標準曲線對目的基因進行定量分析的PCR技術[31]。

qPCR常用的檢測方法之一是使用熒光染料，這是一種插入染料，可以與雙鏈DNA結合，DNA的增加與熒光強度成正比，因此可以通過插入染料的熒光強度來量化擴增的DNA。在食源性致病菌的檢測中通常使用SYBR Green作為qPCR的熒光染料，SYBR Green熒光染料是一種具有綠色激發波長的不對稱菁類熒光素，最大吸收波長和發射波長分別約為497和520 nm。D’SOUZA等[32]使用SYBR Green結合qPCR對人工接種創傷弧菌的50多個海鮮樣本進行檢測，以創傷弧菌的gyrB基因為檢測目標基因設計引物，LOD為102CFU/mL，明顯高于常規PCR，且整個檢測過程僅需9～12 h。

qPCR的另一種檢測方法是使用探針，包括Taqman熒光探針和分子信標。在對食源性致病菌的檢測中，使用Taqman探針較為普遍。一項使用TaqMan qPCR檢測大腸桿菌O157:H7的研究表明，該技術在牛肉中的LOD可達到100CFU/mL[33]。

PCR檢測食源性致病菌的例子及比較如表2所示。

表2 用于食源性致病菌檢測的PCR技術Table 2 PCR techniques for detection of foodborne pathogens

3 生物傳感器

生物傳感器(biosensesor)是對生物物質敏感并能將其濃度轉換為電信號進行檢測的設備。生物傳感器的優點是可以對食品樣品中的微生物活性進行快速、經濟、高效的分析。生物傳感器由識別元件和轉導元件組成，其中，識別元件是生物衍生分子，轉導元件則是將對識別元件產生的物理化學反應轉化為可測量的信號[37]。生物傳感器通常是根據轉導元件的類型進行分類，可分為光學生物傳感器、電化學生物傳感器、熱學生物傳感器、壓電生物傳感器和半導體生物傳感器等。其中，光學生物傳感器、電化學生物傳感器在食源性致病菌檢測中具有較高的特異性和靈敏度，并可對食源性致病菌進行原位快速檢測，因此應用較廣泛。

3.1 光學生物傳感器

光學生物傳感器是食源性致病菌檢測中應用最廣泛的生物傳感器，目前已經開發出商品化產品。光學生物傳感器基于多種成熟可靠的技術，包括光吸收、比色、化學發光、熒光、光偏轉、表面等離子共振體(surface plasmon resonance，SPR)和總內部反射率。其中，SPR生物傳感器具有突出的靈敏度和復用能力，這些獨特的優勢使得光學生物傳感器在食源性致病菌的檢測中發展迅速；比色生物傳感器易于使用，對食源性致病菌的檢測效率極高，而且便攜、成本低，具有較好的應用前景。

SPR生物傳感器具有無標簽檢測、實時監測生物分子相互作用、傳感芯片可重復使用以及將光纖和波導結構用于光傳輸的小型化等優點。SPR現象是指當偏振光以特定的角度入射到2種不同折射率的介質(通常是玻璃或水和附著在玻璃表面的金屬或金屬氧化物)界面時，就產生了表面等離子體激元，從而使反射光的強度在一個特定的角度上減小，這個角度叫做共振角，通過測量反射率、角度或波長隨時間的變化可以得到傳感器信號。在所有的構象中，SPR現象可以使傳感器表面的折射率發生直接的、無標簽的、實時的變化，這些變化與生物分子的濃度成比例[38]，因此，SPR生物傳感器使得實時測量生物分子檢測食源性致病菌成為可能，并且具有很高的靈敏度。KUSHWAHA等[39]使用以ZnO為基質的石墨烯SPR生物傳感器對假單胞菌進行檢測時發現，氧化鋅大大提高了SPR信號，使得石墨烯上的分子識別位點與假單胞菌細胞緊密結合，該SPR生物傳感器較傳統的生物傳感器具有更高的靈敏度，為187.43 deg/RIU。

比色生物傳感器可以通過反應液顏色的變化，無需任何分析儀器實時地用肉眼觀察到食物樣品中的致病菌。SRISA-ART等[40]使用比色生物傳感器檢測牛奶樣品中的鼠傷寒沙門氏菌，LOD為103CFU/mL，表明可以做到快速定量檢測。比色生物傳感器檢測法在食品致病菌中展現出的優勢，將推動其在肉制品加工中的研究和應用。

3.2 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器是基于電極和樣品之間的界面發生化學反應而引起的電流或電位差的變化檢測微生物的生物傳感器，具有良好的靈敏度、簡便性和快速性[41]。在電化學生物傳感器中，廣泛使用分子、抗體、適配體和核酸等作為傳感層，傳感層的選擇對于檢測的準確度和靈敏度起著關鍵作用[42]。用于設計電極的材料包括金、鉑、石墨、導電聚合物和改性碳作為介體分子，電化學生物傳感器可以通過使用介體分子增強檢測的靈敏度，因為介體分子具有放大載點基礎產生響應電流的能力[37]。VASQUEZ等[43]開發了一種電化學生物傳感器，通過使用固定在絲網刷碳電極表面的生物素抗體對羅非魚的無乳鏈球菌進行檢測，可以在101～107CFU/mL的較低濃度檢測到無乳鏈球菌。CHEN等[44]使用碳納米管(carbon nanotube，CNT)作為氧化還原探針，該納米管與信號探針相連，用于放大電化學信號以檢測結合分歧桿菌。

生物傳感器檢測食源性致病菌的例子及比較如表3所示。

表3 用于食源性致病菌檢測的生物傳感器技術Table 3 Biosensesor techniques for detection of foodborne pathogens

4 結語

振動光譜學、PCR和生物傳感器檢測技術結合適當的化學計量等分析方法可以做到對食源性致病菌的快速檢測，在食品產業中具有較好的應用前景，但各技術又具有自己的優勢和問題。

振動光譜學技術結合化學計量法具有良好的特異性、準確性，并且可以做到原位、無損的快速檢測。然而，食品組分復雜多變，食品基質自身的熒光會對光譜產生影響，這給使用光譜學技術檢測食源性致病菌帶來挑戰。因此，需要大量的光譜數據并結合科學的光譜預處理技術、適當的化學計量學，才能建立可靠的預測模型。PCR和生物傳感器檢測技術，通常成本較高，同時生物傳感器檢測方法需要專業的研究人員，且設備復雜，但是由于檢測時間短、特異性強，通常比傳統的培養方法更具有時間效益。

食源性致病菌的快速檢測是食品行業亟待解決的關鍵點，不僅需要持續開發新技術，還需要對現有快速檢測技術進行對比分析以明確最有效的檢測方法并推廣應用，提高食品安全性。