硒化牡丹籽粕多糖的抗氧化研究

裴晉紅，宋英達，武翠玲

(長治醫學院，山西 長治， 046000)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)為芍藥科、芍藥屬植物，是原產我國的傳統名花與藥用植物，具有抗氧化、免疫調節等多種生物活性[1]。1960～1970年人們發現牡丹籽中含有“油”，開始利用牡丹籽進行粉碎榨油，2011年，我國衛生部正式批準牡丹籽油為新資源食品，油用牡丹種植及開發利用獲得迅猛發展。油用牡丹籽提取油后剩余大量餅粕，含有大量的生物活性物質[2-5]。目前對牡丹籽粕的研究較少，主要轉化為飼料后用于養殖，附加值較低，造成較大的浪費。

多糖是一類重要的天然生物活性物質，具有抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8]、增強免疫[9-10]、降血脂、降血糖[11-12]、抑菌[13]等生物學功能，在臨床上被用于治療多種疾病[14]。牡丹中含有大量的多糖，目前研究較多的是牡丹丹皮多糖[15]、牡丹籽果莢多糖[16]、牡丹雄蕊多糖[17]和牡丹葉片多糖[18]等，鮮見有牡丹籽粕多糖(peony seed dreg polysaccharides,PSDP)的系統研究[19]。研究主要集中在分離提取方法探索與工藝優化，較少研究者進行了結構、清除自由基等研究。

硒化多糖通過化學修飾方法將多糖與無機硒結合成有機硒化合物[20]，使硒和多糖的生理活性和藥理功能得到優化，增強多糖的抗氧化活性[21]。人工合成的硒化多糖有硒化米胚多糖[22]、梭柄松苞菇富硒多糖[23]和蓮藕多糖[24]等，對于硒化牡丹籽粕多糖(selenium-containing peony seed dreg polysaccharides，Se-PSDP)及其抗氧化的研究還鮮有報道。

利用水提醇沉法從牡丹籽粕中提取粗多糖PSDP，之后經離子交換層析制得牡丹籽粕多糖PSDPⅠ、PSDPⅡ及PSDP Ⅲ，對PSDP Ⅲ進行硒化修飾后獲得具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphengl-2-picrylhydrqzy,DPPH)自由基清除能力、·OH清除能力和DNA氧化損傷抑制活性的Se-PSDP Ⅲ。通過建立H2O2誘導的RAW264.7巨噬細胞氧化損傷模型，從細胞水平研究Se-PSDP Ⅲ可能的抗氧化作用，為Se-PSDP的進一步開發利用奠定了理論基礎，同時為牡丹籽粕的綜合高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

牡丹籽粕,山西智華牡丹生物科技公司；巨噬細胞系RAW 264.7,中科院上海生命科學院；超氧化物岐化酶(superoxide,SOD)檢測試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxide,GSH-Px)檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所；鄰菲羅啉,索萊寶生物科技有限公司；FeSO4、H2O2、亞硒酸鈉,上海生物工程有限公司。

Allegra 64R高速冷凍離心機，美國Beckman公司；AKATA Pure 25蛋白純化系統，美國GE公司；Sunrise-Basic酶標儀，瑞士TECAN公司；DMI3000B倒置熒光顯微鏡，德國LEICA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡丹籽粕多糖的制備及硒化修飾

經超臨界萃取油脂后得到的牡丹籽粕，經熱水浸提、Sevag法脫蛋白[25]、透析、乙醇沉淀和冷凍干燥后得到牡丹籽粕粗多糖。采用DEAE-Sepharose FF離子交換層析對粗多糖進行分級：首先用雙蒸水平衡層析柱，按照質量濃度1.0 mg/mL進行上樣，分別采用雙蒸水、0.2 mol/L NaCl、0.4 mol/L NaCl進行洗脫，H2SO4-苯酚法檢測多糖含量，將收集的多糖溶液透析，冷凍干燥。采用HNO3-亞硒酸鈉法[26]，按照多糖-亞硒酸鈉質量比5∶4在70 ℃下反應10 h，制得Se-PSDP多糖，紫外分光光度法檢測硒含量。

1.2.2 RAW264.7巨噬細胞培養

將RAW264.7巨噬細胞接種于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養，當細胞的融合度達到80%～90%時，用質量濃度2.5 g/L胰酶消化，用于后續實驗。

1.2.3 Se-PSDP Ⅲ對RAW264.7巨噬細胞活力的影響

將RAW264.7的細胞密度調整為2×105個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養24 h后棄去培養基，加入含Se-PSDP Ⅲ、體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。Se-PSDP Ⅲ的終質量濃度分別為0、100、200、300、400和500 μg/mL，每個濃度設置3個重復孔。培養24 h后加入CCK8溶液，繼續培養3 h，于450 nm波長處檢測吸光度，細胞存活率計算如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞氧化損傷模型的建立

將RAW264.7的細胞密度調整為2×105個/mL，接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養24 h后棄去培養基，加入含H2O2、體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。H2O2的終濃度分別為0、0.1、0.2、0.3和0.4 mmol/L，每個濃度設置3個重復孔。培養24 h后加入CCK8溶液，繼續培養3 h，于450 nm波長處檢測吸光度，細胞存活率計算如公式(2)所示:

(2)

1.2.5 DPPH自由基清除率檢測[27]

分別取20 μL質量濃度為0.5、1.0和4.0 mg/mL的多糖樣品，加入60 μmol/L的DPPH溶液 (以體積分數95%乙醇作為溶劑) 100 μL，在室溫下密封避光反應60 min，然后檢測517 nm波長處的吸光度，清除率計算如公式(3)所示：

(3)

式中:As,實驗組吸光度;Ab,用體積分數95%乙醇代替DPPH后的吸光度；Ac，用雙蒸水代替樣品后的吸光度；每組做3次重復實驗，以質量濃度200 μg/mL VC作為陽性對照。

1.2.6 ·OH清除率檢測

取40 μL濃度為2 mmol/L的FeSO4，加入40 μL濃度為2 mmol/L的鄰菲羅啉及80 μL多糖樣品后，加入40 μL體積分數0.03%的H2O2啟動反應，37 ℃孵育60 min，于536 nm波長處檢測吸光度，清除率計算如公式(4)所示：

(4)

式中:As,實驗組吸光度;An,用雙蒸水代替多糖后的吸光度;Ab,用雙蒸水代替H2O2后的吸光度;每組做3次重復實驗。

1.2.7 DNA氧化損傷抑制實驗

取8 μL PUC18質粒DNA，加入2 μL 2 mmol/L FeSO4與8 μL待測組分，輕輕混勻后，加入2 μL 0.1 mmol/L H2O2啟動反應，37 ℃水浴10 min，質量濃度10 g/L瓊脂糖凝電泳分析，以雙蒸水代替樣品作為損傷組。

1.2.8 RAW264.7巨噬細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的檢測

將RAW264.7巨噬細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板中，無血清培養液同步化饑餓培養24 h后，分為對照組、H2O2組(0.2 mmol/L H2O2)和H2O2+Se-PSDP Ⅲ組(0.2 mmol/L H2O2+100 μg/mL Se-PSDP Ⅲ)，分別培養24 h。用無血清培養基按體積比1∶1 000稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmol/L，之后每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，37 ℃避光孵育40 min后，用磷酸鹽緩沖液(phospate buffer saline,PBS)洗滌細胞3次。將6孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞光鏡下及熒光激發狀態下的形態。

1.2.9 Se-PSDP Ⅲ對RAW264.7巨噬細胞內抗氧化酶活力的調節

將RAW264.7巨噬細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板中，無血清培養液同步化饑餓培養24 h后，分為對照組、H2O2組(0.2 mmol/L H2O2)、H2O2+ Se-PSDP Ⅲ組(0.2 mmol/L H2O2+100 μg/mL Se-PSDP Ⅲ)組，分別培養24 h，收集細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，收集上清液，按照試劑盒說明書對SOD及GSH-Px活力進行檢測。

2 結果與分析

2.1 牡丹籽粕多糖的制備與硒化修飾

利用DEAE-Sepharose FF離子交換層析對牡丹籽粕粗多糖進行分級，分別采用雙蒸水、0.2 mol/L NaCl和0.4 mol/L NaCl進行洗脫，獲得牡丹籽粕多糖PSDPⅠ、PSDPⅡ和PSDP Ⅲ，得率分別為4.1%、3.6%和31%。其中PSDP Ⅲ得率最高(圖1-a)，且Se-PSDP Ⅲ較PSDP Ⅲ表現出更強的DPPH清除能力(圖1-b)。后續以Se-PSDP Ⅲ為研究對象并測得其硒含量為1.1 mg/g。

2.2 Se-PSDP Ⅲ及H2O2對RAW264.7巨噬細胞活力的影響

由圖2-a可知，與空白組相比，質量濃度100、200、300、400和500 μg/mL的Se-PSDP Ⅲ對巨噬細胞存活率無明顯影響，說明該濃度可以用于后續的ROS實驗。由圖2-b可知，0.1、0.2 mmol/L的H2O2對巨噬細胞存活率影響較小，故后續實驗選擇濃度為0.2 mmol/L的H2O2建立氧化損傷細胞模型。

a-DEAE-Sepharose FF陰離子交換色譜圖; b-Se-PSDP Ⅲ與PSDP的DPPH清除率比較圖1 PSDPⅢ陰離子交換色譜圖和Se-PSDP Ⅲ與PSDPⅢ的DPPH清除率比較圖Fig.1 Elution profile of PSDP Ⅲ on DEAE-Sepharose FF chromatography and comparison of DPPH scavenging activity between Se-PSDP Ⅲ and PSDP Ⅲ注：*表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

a-Se-PSDP Ⅲ; b-H2O2圖2 Se-PSDP Ⅲ和H2O2對RAW264.7巨噬細胞活力的影響Fig.2 Relative cell viability of RAW264.7 induced by Se-PSDP Ⅲ and H2O2

2.3 DPPH自由基和·OH清除能力

如圖3-a所示，Se-PSDP Ⅲ對DPPH自由基的清除能力呈現出一定的濃度依賴性，且4 mg/mL的Se-PSDP Ⅲ與200 μg/mL的VC作用相當，對DPPH的清除率可達到80%左右。由圖3-b可知，Se-PSDP Ⅲ表現出較強的·OH清除能力，并且具有一定的濃度依賴性。當質量濃度為4 mg/mL時，Se-PSDP Ⅲ的·OH清除率為93.7%。

a-DPPH自由基清除率; b-·OH清除率圖3 Se-PSDP Ⅲ的DPPH自由基和·OH清除率Fig.3 DPPH and hydroxyl radical scavenging activities of Se-PSDP Ⅲ

2.4 Se-PSDP Ⅲ對DNA氧化損傷的抑制作用

如圖4所示，泳道2為無損傷組，質粒DNA結構完好，超螺旋結構質粒DNA(supercoiled DNA, scDNA)含量最高。泳道3為損傷組，DNA氧化損傷嚴重，scDNA基本消失，質粒DNA被損傷成為線性結構(linear DNA,lDNA)。泳道1為Se-PSDP Ⅲ保護組，在lDNA下方出現了少量的scDNA，這表明DNA氧化損傷程度有所降低，說明Se-PSDP Ⅲ具有一定的抑制DNA氧化損傷的能力。

1-H2O2+ FeSO4+ Se-PSDP Ⅲ；2-PUC18；泳道3 H2O2+ FeSO4圖4 Se-PSDP Ⅲ抑制DNA氧化損傷的能力Fig.4 Protective effect of Se-PSDP Ⅲ on oxidation-induced DNA damage

2.5 Se-PSDP Ⅲ對H2O2誘導的RAW264.7巨噬細胞內活性氧水平的影響

活性氧是指化學性質活潑的具有含氧基團的化合物。ROS過度增加或持續存在可對細胞形成氧化應激，造成多種損傷。H2O2是研究ROS的重要工具，H2O2可迅速穿過細胞膜，通過Fention反應，生成·OH，·OH激發鏈式反應，產生更多的ROS，可用于模擬ROS對RAW264.7巨噬細胞的氧化損傷。如圖5所示，0.2 mmol/L H2O2處理的RAW264.7巨噬細胞相較對照組細胞具有更強的熒光強度。0.2 mmol/L H2O2和100 μg/mL Se-PSDP Ⅲ處理組的細胞與對照組基本一樣，細胞內幾乎檢測不到熒光。該結果表明Se-PSDP Ⅲ可以有效降低RAW264.7巨噬細胞中的ROS水平。

圖5 DCFH-DA探針法檢測RAW264.7巨噬細胞內活性氧(×100)Fig.5 Intracellular ROS in RAW264.7 macrophages indicated as green fluorescence by DCFH-DA

2.6 Se-PSDP Ⅲ對H2O2介導的RAW264.7巨噬細胞內抗氧化酶活力影響

細胞內存在完善的抗氧化防御體系，能夠直接清除自由基，使自由基處于動態平衡。如SOD、GSH-Px等。Se-PSDP Ⅲ對RAW264.7巨噬細胞內抗氧化酶活力的影響如圖6所示。

a-SOD的相對酶活力; b-GSH-Px的相對酶活力圖6 Se-PSDP Ⅲ對H2O2誘導的RAW264.7巨噬細胞內SOD和GSH-Px活力的影響Fig.6 Effect of Se-PSDP Ⅲ on SOD and GSH-Px activities in RAW264.7 stimulated by H2O2

與對照組相比，H2O2處理的RAW264.7巨噬細胞內抗氧化酶活力都有所下降，而質量濃度100 μg/mL的Se-PSDP Ⅲ可使胞內SOD相對活力從82.6%升高到97.5%，GSH-Px相對活力從95.3%升高到113.3%，差異具有顯著性。該結果表明Se-PSDP Ⅲ對H2O2介導的RAW264.7巨噬細胞內抗氧化酶活性具有正向調節作用。

3 結論與討論

牡丹籽粕粗多糖經陰離子交換柱層析后制得PSDPⅠ、PSDPⅡ和PSDP Ⅲ，其中PSDP Ⅲ得率較高，PSDP Ⅲ經硒化修飾后抗氧化活性得到一定程度的提高，且穩定性和重現性也較好，所以將牡丹籽粕硒化多糖Se-PSDP Ⅲ作為后續研究對象。牡丹籽粕硒化多糖Se-PSDP Ⅲ具有較強的DPPH自由基清除能力、·OH清除能力及DNA氧化損傷抑制能力。Se-PSDP Ⅲ可以降低氧化損傷后巨噬細胞內ROS的水平，提高胞內SOD與GSH-Px的活性。細胞內ROS的水平及SOD與GSH-Px的活性是評價細胞氧化應激水平的關鍵指標，表明Se-PSDP Ⅲ可能是通過調節細胞氧化還原系統，對H2O2引起的巨噬細胞氧化損傷起到保護作用。本研究將為牡丹籽粕多糖在食品、保健品、美容、醫藥等領域的進一步開發利用奠定理論基礎，為牡丹籽粕的高值化利用提供參考。