大豆發酵液的抗氧化活性

陳彬和，趙炳天，孫亞娟，李云興*

1(合成與生物膠體教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫，214122)

大豆是我國一種重要的糧食作物，常被發酵制成豆瓣醬、腐乳、醬油等食品，發酵能夠通過提高活性物的濃度來提升大豆的抗氧化活性。大豆中含有許多抗氧化物質，例如酚酸、黃酮以及類黃酮等多酚類化合物[1]，許多研究表明，發酵提高了大豆多酚的提取濃度，同時，其還原能力以及清除自由基的能力也得到提高[2-5]。發酵能夠將大分子蛋白分解為末端氨基酸殘基具有抗氧化活性的小分子多肽[6]，李慧娟等[7]報道，對大豆進行發酵提高了小分子多肽的產量，同樣，其清除自由基的能力得到提高。許多疾病的發生都是由于機體內的氧化和抗氧化水平失衡[8-9]，發酵的大豆能夠通過提升抗氧化水平來預防心血管疾病和保護腸道健康。研究表明，通過給小鼠喂食發酵的大豆能夠提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)等抗氧化酶的活性和抑制脂質過氧化，同時肥胖小鼠的血脂含量下降[10-11]。另外，發酵的大豆可以通過抑制氧化損傷來保護小鼠的腸道[12]。

大豆發酵的抗氧化研究主要是其在食用方面帶來的價值，而對其通過抗氧化方式來保護皮膚的研究較少。角質細胞位于皮膚的最外層，可以阻擋外界刺激對皮膚的侵害。紫外照射、有毒的化學物質等能通過活性氧(reactive oxygen species, ROS)來損傷角質細胞，因此為角質細胞提供抗氧化保護有利于維持皮膚健康。該研究利用枯草芽孢桿菌制備了大豆發酵液(soybean fermentation broth,S-FB)，并探討了其在人永生化角質形成細胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)內的抗氧化作用，以明確其對于保護皮膚健康的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，無錫歐尚超市；枯草芽孢桿菌，江南大學生物活性物發酵制備實驗室提供；2,2′-聯氨雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)]，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；HaCaT細胞，北京北納生物科技有限公司；2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT),美國Sigma公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, ABAP)，百靈威科技公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、ECL化學發光試劑、SOD和CAT酶活力檢測試劑盒，碧云天生物技術研究所；核因子E2相關因子2 (nuclear factor erythroid-2-related factor 2, Nrf2)，圣克魯斯生物技術上海有限公司。

1.2 儀器與設備

Tecan Infinite 200 Pro型多功能酶標儀，瑞士Tecan公司；Synergy H4型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；TU-1901型雙光束紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；FE20型pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DDS-307型電導率儀，上海雷磁儀器有限公司；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀、DYCZ-40K型轉印電泳儀、DYY-5D型電腦三恒多用電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 S-FB的制備及處理

將大豆浸泡過夜，按照質量比1∶7的比例與去離子水混合并打碎制成大豆勻漿，取10 g勻漿加入39.5 g水，滅菌20 min，得到大豆培養基。冷卻后接入0.5 mL OD600 nm為0.2的枯草芽孢桿菌懸浮液，并于37 ℃振蕩培養箱中發酵72 h。將發酵前和發酵后的大豆培養基分別用220 nm的微孔濾膜進行過濾，去除菌和大豆殘渣，最終得到S-FB和未發酵的大豆提取液(soybean extract,SE)。

1.3.2 ABTS陽離子自由基清除能力法測試抗氧化活性

制備2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液，然后取7.7 mg ABTS溶解于2 mL過硫酸鉀溶液中。16 h后，將其稀釋成734 nm處吸光度為0.9的ABTS工作液。分別移取50 μL SE和S-FB于96孔板中，然后加入150 μL ABTS工作液，反應10 min后測其在734 nm處吸光度As。以蒸餾水代替樣品作為對照組，測得其吸光度為Ac。ABTS陽離子自由基的清除率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 總酚含量的檢測

采用普魯士藍法檢測SE和S-FB中的總酚含量[13]。取1 mL樣品，并依次加入0.2 mL的0.008 mol/L鐵氰化鉀溶液、0.100 mol/L FeCl3溶液和0.100 mol/L 鹽酸溶液，均勻混合后于室溫下反應15 min。最后用水稀釋至10 mL,于730 nm的波長下檢測溶液的吸光度。以沒食子酸酯為標準品進行測試，得到二項方程Y=-3.485 5X2+1.897 3X+0.008 0，R2=0.999 3。樣品中的總酚含量通過該方程計算得到。

1.3.4 總肽含量的檢測

采用雙縮脲法分別對S-FB和SE中的總肽含量進行檢測。先分別配制雙縮脲試劑A (0.10 g/mL的NaOH溶液)和雙縮脲試劑B (0.01 g/mL的CuSO4溶液)。將樣品與100 g/L三氯乙酸以1∶1的質量比混合，30 min后過濾。取1 mL濾液，并依次加入2 mL雙縮脲試劑A和2 mL雙縮脲試劑B。接著于室溫下反應15 min，在540 nm波長下檢測吸光度。以牛血清白蛋白為標準品進行測試，并得到線性方程Y=0.356 7X+0.007 6，R2=0.997。樣品中的總肽含量通過該方程計算得到。

1.3.5 細胞內ROS水平的檢測

利用熒光探針DCFH-DA來檢測HaCaT細胞內的ROS。按照2×104/孔的密度接種細胞。細胞與樣品培養結束后，加入20 μmol/L熒光探針DCFH-DA溶液，在培養箱中孵育30 min，加入0.6 mmol/L的ABAP溶液，于熒光酶標儀中進行0～60 min的動力學檢測，發射波長485 nm，激發波長535 nm。

1.3.6 S-FB對細胞內ROS水平的影響

HaCaT細胞分別與體積分數為0%、5%、10%和20%的S-FB培養12 h，然后按照1.3.5小節的方法檢測ROS。

HaCaT細胞與400 μmol/L H2O2培養2 h，然后去除培養液，并在細胞中分別加入體積分數為5%、10%和20%的S-FB，繼續培養2 h。設置2組細胞分別與400 μmol/L的H2O2和體積分數為5%的S-FB培養2 h，未處理細胞作為對照組。最后按照1.3.5小節的方法檢測細胞內的ROS水平。

1.3.7 免疫印跡法測定Nrf2的表達

將HaCaT細胞與體積分數5% S-FB分別進行0、12、24、36和48 h的培養，每隔12 h給細胞換新鮮的培養液。然后除去培養基并用裂解液提取細胞內蛋白。收集裂解液并于10 000 r/min下離心8 min，保留上清液。將提取的蛋白加熱變性，然后在Tris-甘氨酸電泳緩沖液中進行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白分離。在同樣的緩沖液中對蛋白進行90 min的轉印電泳，使蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，轉印完畢的膜在50 g/L脫脂奶粉中封閉1 h，并用TBST緩沖液洗滌，然后與一抗(Nrf2或β-actin)于4 ℃過夜孵育，再次洗滌，繼續與二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG)室溫孵育1 h。用ECL化學發光試劑使蛋白條帶顯色，用Image Lab軟件對條帶的灰度值進行定量。

1.3.8 S-FB對細胞內SOD和CAT酶活力的影響

SOD和CAT酶活力：按照SOD和CAT酶活力檢測試劑盒對1.3.7小節提取的蛋白進行檢測。

紫外線B (ultraviolet radiation B, UVB)損傷測試：體積分數為5%的S-FB分別處理HaCaT細胞0、36和48 h，然后用365 μW/cm2的UVB照射細胞5 min，于培養箱中繼續培養2 h，然后每孔加入100 μL 0.5 g/mL的MTT溶液，4 h后用二甲基亞砜溶解生成的甲臜，最后用酶標儀在490 nm下檢測吸光度。

1.3.9 統計學分析

數據均由平行測試得到，以平均值±標準差表示。顯著性差異通過GraphPad prism7的ANOVA-Tukey計算得到。P<0.05表示結果具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 S-FB的ABTS陽離子自由基清除能力

大豆中含有豐富的蛋白質和多酚類化合物，在發酵過程中，微生物產生的酶能提高大豆多肽的產量，并且促進大豆中多酚化合物釋放。如表1所示，S-FB和SE中的總酚質量濃度分別為0.89和0.31 g/L，總肽質量濃度分別為2.30和0.70 g/L。S-FB的總酚和總肽含量比SE分別提高了187%和229%。多酚和大豆多肽通常具有抗氧化活性。ABTS陽離子是一種能夠相對穩定存在于水溶液中的自由基，其可以通過電子轉移被清除。由于不易受外界因素干擾，ABTS陽離子自由基清除能力能夠較為準確地體現樣品的抗氧化活性。如圖1顯示，體積分數為1%、2%、5%和10% S-FB對ABTS陽離子自由基的清除效果為(30.31±0.49)%、(49.48±0.53)%、(78.24±0.55)%和(93.88±0.13)%，都高于對應體積分數的SE清除效果〔(6.00±1.39)%、(11.13±0.57)%、(20.40±0.35)%和(33.49±1.07)%〕，其中1% S-FB對ABTS陽離子自由基的清除效果接近10% SE。因此，發酵可以提高S-FB中的多酚和多肽含量，使其具有優異的抗氧化活性。

表1 S-FB和SE中的總酚和總肽含量(n=3) 單位：g/LTable 1 Contents of total polyphenols and total peptides in S-FB and SE (n=3)

圖1 S-FB和SE的ABTS陽離子自由基清除能力(n=3)Fig.1 ABTS cation radicalscavenging activity of S-FB and SE (n=3)

2.2 S-FB對細胞內ROS水平的影響

研究了S-FB對HaCaT細胞內ROS的影響來表明其抗氧化作用。為了排除滲透壓和pH值對測定結果的干擾，檢測了S-FB的電導率和pH值。細胞培養基，即杜氏改良Eagle培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM),其電導率超出儀器量程，由表2可知，0%、5%、10%和20% S-FB (雙重蒸餾水配制)的電導率分別為2.59、142.20、317.00和693.00 μS/cm，相比DMEM，S-FB體積分數變化導致的電導率差異可忽略。另外，0%、5%、10%和20% S-FB的pH值在7.2～7.5范圍內(DMEM配制)，S-FB對pH的影響較小。因此可以忽略滲透壓和pH對S-FB的影響。

表2 S-FB的電導率和pH值(n=3)Table 2 Conductivity and pH value of S-FB (n=3)

圖2-a為HaCaT細胞與S-FB培養12 h后的ROS水平。由圖可知，5%、10%和20% S-FB分別處理12 h后，細胞內的ROS水平提高，且ROS隨著S-FB體積分數的增加而增加。抗氧化劑能夠誘導ROS的生成，另有報道表明抗氧化劑能夠清除細胞在氧化應激中生成的ROS[14-16]。QIN等[17]提出抗氧化劑對ROS的清除作用在ROS高水平的細胞中更優異。因此，本實驗中S-FB提高HaCaT細胞內ROS可能是由于該細胞本身的ROS水平較低所致。于是用H2O2來誘導ROS，并探討S-FB對該細胞內ROS的影響。如圖2-b所示，H2O2在細胞內提高了ROS水平，該效果接近5% S-FB對細胞內ROS的影響，H2O2+5% S-FB、H2O2+10% S-FB和H2O2+20% S-FB (先用H2O2刺激細胞，再用S-FB培養細胞)導致的細胞內ROS水平均低于H2O2。結果表明，S-FB能夠清除H2O2誘導的ROS。另外，5%、10%和20% S-FB對ROS的誘導作用依次增強，而H2O2+S-FB (5%、10%和20%)導致的ROS水平都低于5% S-FB，表明H2O2提高細胞的ROS水平后，S-FB誘導ROS的作用減弱。因此，S-FB對ROS的影響與HaCaT細胞的ROS水平(S-FB處理前)有關，其清除ROS的效果在ROS水平高的細胞中更加顯著，同時誘導ROS的作用減弱。因此，S-FB能夠通過降低細胞的氧化應激反應來保護細胞。

a-未添加H2O2; b-添加H2O2圖2 S-FB對HaCaT細胞內ROS水平的影響(n=6)Fig.2 The effect of S-FB on the intracellular ROS level in HaCaT cells (n=6)

2.3 S-FB對細胞內Nrf2水平的影響

Nrf2即核因子E2相關因子2，是抗氧化通路中的關鍵轉錄因子，其通過調控抗氧化基因的表達來控制抗氧化酶的合成，從而對細胞內的氧化還原狀態進行調節[18-19]，Nrf2的表達量關系著細胞的抗氧化能力。由圖3可知，5% S-FB分別處理12、24、36和48 h后，細胞內的Nrf2蛋白的相對含量分別為1.85、2.04、2.64和2.65。

圖3 S-FB對HaCaT細胞內Nrf2的影響Fig.3 The effect of S-FB on the intracellular Nrf2 in HaCaT cells

結果表明，S-FB上調了HaCaT細胞中的Nrf2水平，因此，S-FB能夠通過激活細胞的Nrf2相關抗氧化通路來發揮抗氧化作用并保護HaCaT細胞。

2.4 S-FB對細胞的SOD和CAT酶活力以及抗氧化能力的影響

抗氧化酶的增加能夠提高細胞的抗氧化能力[20-21]。

圖4-a和4-b分別是細胞與5% S-FB培養后的SOD和CAT酶活力。常規HaCaT細胞的SOD和CAT酶活力分別為8.16和13.19 U/mg。S-FB分別處理12、24、36和48 h后，SOD酶活力分別為7.82、5.91、10.81和10.78 U/mg，CAT酶活力分別為13.19、11.35、16.34和16.05 U/mg。細胞與5% S-FB分別培養36和48 h后，其SOD酶活力相比常規HaCaT細胞分別提高了32.5%和32.1%，CAT酶活力分別提高了19.6%和17.5%。細胞的抗氧化酶活力提高后，進一步檢驗了其抗氧化能力。UVB能夠誘導ROS生成，并造成細胞氧化損傷。如圖4-c所示，5% S-FB分別處理36和48 h的細胞在UVB損傷中的存活率都是常規HaCaT細胞的1.3倍。因此，S-FB能夠增強HaCaT細胞的SOD和CAT酶活力，并提升了其抗氧化能力。

圖4 S-FB對HaCaT細胞的SOD和CAT酶活力以及抗氧化能力的影響(n=3)Fig.4 The effect of S-FB on SOD and CAT activities and the antioxidant capacity in HaCaT cells (n=3)注：*代表差異顯著(P<0.05)

3 結論

以上結果表明，發酵提高了S-FB中的總酚和總肽含量，并且增強了其對ABTS陽離子自由基的清除能力。通過研究S-FB在HaCaT細胞中的抗氧化作用得到其能夠降低細胞的氧化應激反應，還可以激活Nrf2抗氧化通路并提高細胞的抗氧化能力。因此，S-FB具有良好的抗氧化效果，同時能以抗氧化的方式來保護HaCaT細胞。

HaCaT細胞本身的ROS水平較低，當氧化刺激提高其ROS水平時，S-FB能夠清除增加的ROS，但S-FB在正常HaCaT細胞內會誘導ROS生成。菌株影響著發酵液的活性成分，下一步工作希望通過篩選菌株來制備抗氧化性能優異但ROS誘導作用減弱的發酵液。