肽基脯氨酰順反異構酶及細胞周期蛋白D1在胃腸間質瘤中表達的臨床意義

王鄧超，王 勇，余 淼，楊玉輝，雷躍華，李 曦，魏 健，張 陳

(1.四川省自貢市第四人民醫院 a.普通外一科，b.病理科，四川 自貢 643000；2.四川省衛生康復職業學院基礎教研室，四川 自貢 643000)

胃腸間質瘤(GIST)的起病機制是和基因發生的突變密切有關[1]。肽基脯氨酰順反異構酶(Pin1)目前被公認是在多種腫瘤發生中的具有催化作用的因子，它不僅可以通過多種途徑誘導正常細胞發生增殖，還能夠阻止正常細胞的凋亡進而導致腫瘤的產生[2]。細胞周期蛋白D1(CyclinD1)是對細胞周期的調控起著重要的調控作用，過度表達的細胞周期蛋白D1會使原本正常生長的細胞出現持續增殖的狀態，進而導致正常細胞轉化為惡性[3]。Pin1與CyclinD1二者之間產生相互作用而共同調節著細胞的周期[4]。本研究應用免疫組化方法檢測55例胃腸間質瘤組織及其瘤旁正常組織中Pin1和CyclinD1的表達情況，探討Pin1、CyclinD1在胃腸間質瘤發生中的作用機制以及二者與臨床病理特征方面的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014～2019年在我科通過手術切除的胃腸間質瘤的腫瘤組織及瘤旁正常組織共計55例，瘤旁組織定義為同一患者與間質瘤腫瘤組織邊緣的距離大于0.5 cm的組織，術后病檢證實該組織中無腫瘤細胞的存在。所有納入的研究對象屬于原發性胃腸間質瘤；患者手術之前均沒有口服伊馬替尼等藥物進行輔助治療；經胸腹CT或者磁共振排除合并其他系統的惡性腫瘤。其中男28例，女27例；年齡>50歲31例，<50歲24例；極低危險度3例，低危險度10例，中危險度18例，高危險度24例。

1.2 方法①組織標本經10%的福爾馬林溶液固定24小時后進行解剖、脫水、石蠟包埋、切片。②采取SP法(鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法)對標本進行免疫組化染色。通過切片加熱、脫蠟、抗原修復、加入抗體、蘇木紫復染、透明、固定、室溫下晾干、封片等步驟完成。

1.3 結果判斷所有組織的染色切片均由我院病理科兩位富有閱片經驗的病理醫師在同一條件下用光學顯微鏡采用雙盲法的方式進行染色圖片閱片。參考NakashimaCritical標準[5]，Pin1結果的判定由染色強度分值及染色陽性細胞數分值的乘積決定：染色強度分值： 沒有染色者計為0分，出現淡黃色的染色顆粒計為1分，出現較多的棕黃色染色顆粒計為2分，出現大量棕黃色染色顆粒計為3分；陽性細胞數分值： 陽性細胞出現率低于1%者設為0分，陽性細胞出現率1%～33%者設為1分，陽性細胞出現率34%～66%者設為2分，陽性細胞出現率≥67%者設為3分；如果染色強度分值和陽性細胞數分值之乘積低于3分時將結果判定為陰性(-)；當二者的乘積大于3分時將結果判定為陽性(+)。CyclinD1結果判定：當組織的細胞核和(或)胞漿呈現出紅色的染色顆粒將CyclinD1的結果定為陽性細胞，如果陽性細胞數低于10%將結果判定為陰性(-)，陽性細胞率高于10%將結果判定為陽性(+)。

1.3 統計學方法應用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行分析。計數資料的比較采用χ2檢驗或確切概率法；計量資料用均數±標準差，比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Pin1蛋白與CyclinD1蛋白在胃腸間質瘤腫瘤組織中的陽性表達率74.5%(41/55)，而在間質瘤的瘤旁組織的表達陽性率卻為0%，兩者之間差異有統計學意義(χ2=65.36，P<0.05)。Pin1蛋白的陽性表達狀態在GIST的不同危險度分級中表達存在差異(P<0.05)，在GIST患者不同性別、年齡、間質瘤的核分裂象水平、間質瘤瘤體的直徑、腫瘤所位于的位置、間質瘤腫瘤細胞的形態、腫瘤是否存在遠處轉移組間無差異(P> 0.05)。CyclinD1蛋白在胃腸間質瘤腫瘤組織的表達陽性率58.2%(32/55)，而在間質瘤的瘤旁組織表達陽性率為0%，差異有統計學意義(χ2=45.13，P<0.05)。CyclinD1的陽性表達狀態在不同GIST的危險度分級中表達存在差異(P<0.05)，在GIST患者不同性別、年齡、間質瘤的核分裂象水平、間質瘤瘤體的直徑、腫瘤所位于的位置、間質瘤腫瘤細胞的形態、腫瘤是否存在遠處轉移組間無差異(P> 0.05)。見表1。Pin1與CyclinD1蛋白在55例GIST瘤體組織中均呈現陽性表達的例數為29例，均呈現陰性表達的例數為11例。

表1 Pin1及CyclinD1在胃腸間質瘤組織中的表達陽性率及與臨床病理特征的關系 [n(%)]

3 討論

GIST是一種由間葉組織來源的腫瘤[6]，大部分該腫瘤可以表達CD117和DOG1，且大多數該腫瘤存在著C-KIT(和)或PDGFRA的活化突變[7]。即使是GIST的原發病灶通過靶向藥物治療聯合規范化的手術切除后其復發率也仍較高[8]。因此在GIST的發病病因、診斷以及治療上迫切需要尋找新的可行途徑。細胞周期的調控與腫瘤的發生有著緊密聯系，其中肽基脯氨酞順反異構酶(Pin1)以及細胞周期素D1(CyclinD1)在正常細胞出現癌變的發展過程中起著至關重要的影響，目前已經在人類的多種腫瘤細胞中發現兩種蛋白質呈現出過度表達狀態[9]。Pin1與腫瘤發生發展中的作用引起了醫學界的廣泛關注。Pin1的表達水平狀態與細胞分裂緊密聯系，在正常細胞中Pin1活性狀態一般很低，然而它在分裂旺盛的細胞中(如大多數腫瘤細胞)卻較容易被檢測到；在高度分化的細胞中Pin1呈現出低表達狀態或幾乎難以檢測到它的存在，目前研究發現Pin1的調控紊亂將引起人類多種疾病的發生，在腫瘤的發生發展中它的作用尤為突出[10]，通過本研究中可以看出，Pin1蛋白在瘤旁組織中呈不表達狀態或僅僅只是在核中呈很微弱的表達，而它在本研究中的間質瘤瘤體組織中則呈現出過表達的狀態。Pin1可以通過多種有絲分裂蛋白對細胞產生影響，因此它能夠參與到細胞的周期調控中而發揮作用。在早期的有關細胞周期研究中發現，通過外界作用去除Pin1的細胞將會停滯于有絲分裂期，然而如果細胞中的Pin1出現過度表達狀態卻會導致本來正常生長的細胞停滯于G2期[11]。研究表明，Pin1如果在細胞中呈現過度表達的狀態會引起正常乳腺上皮細胞朝著惡性方向轉化，同時已經被誘導的惡性表型也會加強，然而敲除細胞的Pin1之后，這種由誘導而呈現出的惡性表型則會出現逆轉，最后將引起癌細胞的調亡[12]。大量分子生物學研究以及Pin1抑制劑的研究表明，Pin1在未來抗癌藥物的研制中有望成為一個新的理想的靶標。

CyclinD1作為細胞周期蛋白的與腫瘤的發生發展以及腫瘤的預后都有著緊密的聯系。在近年研究中發現，CyclinD1在膀胱惡性腫瘤、乳腺惡性腫瘤、甲狀旁腺腫瘤、淋巴瘤、肺惡性腫瘤等惡性腫瘤中的基因過表達以及基因擴增都密切相關。已經證實CyclinD1是細胞周期成分中與腫瘤的發生有最直接聯系的癌基因，它的致癌機制是通過作用于G1期的多種蛋白，與這些蛋白產生相互影響，進而導致細胞周期從G1期進入S期，這樣就加快了細胞周期的速度，最終導致正常生長的細胞產生惡性變。G1期的CyclinD1表達在正常情況下是恒定的，然而在基因擴增、易位的情況下就會引起CyclinD1呈現出過表達的狀態，這將會使得細胞周期縮短，進而異常細胞增殖紊亂及不斷堆積，最終導致細胞癌變發生[13]。研究表明，CyclinD1除了作為原癌基因的身份以外還是重要靶基因之一，pin1可以通過兩種途徑調控CyclinD1的表達，一是在轉錄水平上引起CyclinD1轉錄；二是通過誘導CyclinD1發生構型改變，進而防止CyclinD1從細胞核往細胞漿中遷移發生降解，引起CyclinD1呈現過表達的狀態，最終細胞發生轉化和增殖[14]。

本研究的相關結果表明，Pin1與CyclinD1在間質瘤組織的的陽性表達情況在不同危險度組間表達存在差異。但我們在該研究的統計中發現CyclinD1的陽性表達在不同間質瘤的瘤體直徑組間表達無差異，與國內黃子成等[15]的研究不相一致，提示不同類型的腫瘤細胞表達情況不盡相同，也可能與我們的胃腸間質瘤標本量小有關，也提示了在不同細胞類型的腫瘤中，可能通過不同的機制對不同細胞的生物學行為產生不盡相同的影響。GIST組織中Pin1、CyclinD1呈現過表達的狀態，且二者的表達水平高低與GIST的危險度有關，這樣就表明GIST的發病病因與Pin1和 CyclinD1二者在間質瘤組織中表達過度所引起的正常細胞出現增殖異常有關，二者在GIST的發生發展過程中可能起著相互促進、協同的影響，影響著GIST 的發生以及演變，甚至間質瘤的預后，希望該理論依據能夠可以為胃腸間質瘤的今后臨床上新的治療提供方向。但是本研究納入的間質瘤例數較少，未能對不同基因突變類型、分子靶向治療前后情況以及隨訪不同的預后進行對比和探討，還需要更多的資料及多中心進一步的研究和分析，將有助于進一步闡明Pin1和CyclinD1在胃腸間質瘤中發生、發展的作用及其臨床病理特征、預后的關系。