二甲雙胍對偏頭痛大鼠模型NALP3表達的影響

賈 塘，歐陽穎，母發光，何海蘭

(1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省人民醫院·四川省醫學科學院兒科，四川 成都 610072)

偏頭痛不僅表現血管搏動性疼痛還影響語言、視覺空間記憶和注意力，兒童發病率也呈上升趨勢[1]，Pira等[2]發現患兒的語言及智力可能會出現下降[3，4]。而核苷酸結合寡聚化受體3(neutrophilic alkaline phosphatase 3；NALP3)是炎性反應過程中的一個代表因子[5]，Lenart 認為NALP3是連接血管疾病與神經炎性疾病的樞紐，提出偏頭痛的發病機制可能與炎性小體有關[6]，國內研究也提示NALP3通過神經源性反應參與偏頭痛的發病機制[5，7]。而二甲雙胍能抗炎、緩解疼痛[8，9]。本研究利用這方面的藥理作用探究二甲雙胍干預后偏頭痛大鼠的行為學表現是否改善，并選取NALP3與既是其上游因子也與偏頭痛發病機制嘌呤信號相關的P2X7受體的表達，來判斷二甲雙胍對偏頭痛有無改善作用[10]。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年12月，購入SPF級SD雄性大鼠48只(成都達碩實驗動物有限公司提供)。體重(200±20)g，8～10周齡，按隨機數字表法分為4組：正常對照組、模型組、二甲雙胍組、經典氟桂利嗪組。所有動物飼養于四川省人民醫院動物實驗室，自由活動及飲食，5天內不刺激及干預使大鼠適應環境。

1.2 造模及實驗干預模型組(B組)的制備：Tassorelli法：采取硝酸甘油注射法(硝酸甘油為NO供體，NO不僅能擴張血管，造成無菌性腦炎而且有神經毒性作用，激活三叉神經血管系統，引起偏頭痛，通過爬籠、搔頭、耳紅等行為學表現出來)在頸背部注射10 mg/kg，空白組(A組)則換為同等劑量的生理鹽水(10 mg/kg)，每周注射1次，共4周，記錄行為學表現，造模5 min后行為學評分，持續觀察30 min。具體方法見表1。第二周二甲雙胍組(C組)予以200 mg/(kg·d)(抗炎及治療神經病理性疼痛的劑量[11，12]灌胃)，經典氟桂利嗪組(D組)予以氟桂利嗪1.25 mg/(kg·d)灌胃共3周，剩余組都使用生理鹽水灌胃10 ml/(kg·d)灌胃，最后1次灌胃4小時后予以10%水合氯醛麻醉并留取三叉神經組織進行檢驗。

1.3 實驗儀器及試劑電泳槽JY-SCZ4+、電泳儀JY200C(北京君意東方電泳設備有限公司)；化學發光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)；全功能酶標儀MK3(美國ThermoFisher公司)；硝酸甘油注射液(河南潤弘制藥公司)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥公司)；氟桂利嗪膠囊(重慶科瑞制藥公司)；P2X7R一抗(abcam)；NALP3抗體(genxspan公司)；β-actin抗體(Merckmillipore公司)；BCA蛋白濃度試劑盒(碧云天)。

表1 行為學評分方法[13](累計≥6分則造模成功)

1.4 實驗室檢測①免疫組化測定P2X7受體的表達：取出固定的三叉神經組織制片后，按照試劑盒提示步驟操作，數碼三目顯微攝像系統圖像采集，分析光密度。②Western blot測定NALP3的表達：取大鼠三叉神經節樣本進行裂解，提取總蛋白，再進行抗體孵育，制膜后電泳分析蛋白表達。

1.5 統計學方法應用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。行為學評分、NALP3及P2X7等計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗。再用直線相關分析P2X7及NALP3的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

實驗組及編號說明：A、B、C、D四組：每組編號1～12。A4、C4在第2周及第3周灌胃失誤死亡，D4第4周時由于頸背部皮下注射導致注射處壞死出血感染死亡。

2.1 行為學結果通過Tassorelli法制作偏頭痛模型后，大鼠在3～5 min內迅速表現在籠內來回走動，較為煩躁，在行為學表現上主要為持續搔頭及理毛，個別大鼠出現咬尾，30 min后以上現象逐漸減少，最后閉目臥于籠內。A組大鼠僅在注射生理鹽水 5～8 min后出現上述癥狀，持續時間及程度都較輕。C及D組在藥物干預后上述表現在程度及持續時間上也較前減少，行為學評分顯示：①在造模后，行為學評分累加>6分，提示造模成功。②C與D組實驗藥物干預后大鼠行為學變化評分降低(P<0.01)，二甲雙胍及氟桂利嗪可能緩解偏頭痛大鼠臨床表現。③C與D行為學評分比較差異無統計學意義(P>0.05)。具體評分見表2。

表2 各組大鼠行為學評分 (分)

a與A組比較，P<0.01；b與B組比較，P<0.01

2.2 免疫組化實驗方法測定P2X7的結果偏頭痛模型組P2X7受體的表達量多于其他組(P<0.05)，二甲雙胍及氟桂利嗪干預后P2X7受體表達減少(P<0.05)，表達量上二甲雙胍組少于氟桂利嗪組。見表3及圖1。

表3 大鼠三叉神經節組織P2X7受體平均光密度統計結果

圖1 三叉神經節中使用免疫組化測定P2X7受體分布情況 a:A組；b:B組；c:C組；d:D組(×400，標尺=40 μm) 箭頭所示為P2X7分布的神經元。主要分布三叉神經膠質細胞細胞質及細胞間質，陽性細胞胞質呈黃色或棕黃色

2.3 Western blot測定NALP3結果當與造模后未行藥物干預組相比時二甲雙胍組三叉神經節中NALP3表達明顯降低(P<0.05)，但氟桂利嗪組NALP3表達與模型組差異無統計學意義(P>0.05)，但其表達量的數值上有減少。故二甲雙胍減少炎性小體表達上效果優于氟桂利嗪。見圖2、圖3及表4。

表4 各實驗組大鼠三叉神經節中NALP3蛋白表達

圖2 各組三叉神經節NALP3蛋白的表達

圖3 各組三叉神經節NALP3蛋白western-blot情況

2.4 P2X7受體與NALP3炎性小體的相關性大鼠三叉神經節P2X7受體與NALP3蛋白表達呈正相關(r=0.75，P<0.01)，提示P2X7受體表達增加的同時伴隨NALP3蛋白的表達，兩者共同參與偏頭痛的發病機制。見圖4。

圖4 P2X7受體與NALP3炎性小體的相關性

3 討論

三叉神經節作為炎性介質、血管、三叉神經系統之間的樞紐共同闡述偏頭痛的發病機制，偏頭痛反復發作激活三叉神經系統，促進炎性介質的釋放，炎性因子刺激感覺神經末梢，痛覺信號沿三叉神經傳導經腦干丘腦傳入皮層產生痛覺，對于偏頭痛的治療需要尋找有效且安全的藥物，本實驗選取二甲雙胍作為實驗藥物是因為二甲雙胍能抗炎、減輕神經病理性疼痛及外周敏化，并且二甲雙胍副作用較少，安全性高，不經肝臟代謝，多以原型從腎臟排出。此外，兒童偏頭痛患兒也可從中受益，兒童偏頭痛的長期發作可能造成學習記憶受損，而實驗研究發現低劑量的二甲雙胍長期腹腔注射可以改善學習記憶能力[14]。

二甲雙胍可能通過多個途徑減輕神經源性炎性反應：①直接產生抗炎作用，減少炎性因子的表達，使炎性小體NALP3的表達減少。②激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路，ATP與AMP是神經系統傳遞嘌呤信號的遞質，當AMP/ATP比例升高時AMPK 通路被激活，ATP減少可以導致ATP與其P2X7嘌呤離子受體結合減少，則依賴ATP的鉀離子通道開放減少從而使其下游的NALP3的組裝受抑，從而減輕炎性反應；③二甲雙胍在代謝方面使膽固醇晶體合成減少，而膽固醇晶體是激活NALP3的上游分子[15]。此外，據研究二甲雙胍能通過AMPK-TAB1-P38通路發揮鎮痛作用并且促進巨噬細胞釋放內啡肽抑制膠質細胞JNK-縫隙連接功能，減輕慢性疼痛[11]

綜上，此次實驗結果提示二甲雙胍可能在減少NALP3炎性小體的表達的同時減輕偏頭痛的癥狀，提示二甲雙胍可能對偏頭痛有潛在的治療作用，希望在未來能深入進行相關研究，為二甲雙胍治療偏頭痛提供更多證據。