蛋白質精氨酸甲基轉移酶5促進人卵巢癌HO8910細胞遷移

趙康容，孫愛琴，林瓊，邵根寶

(江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013)

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，其死亡率居婦科惡性腫瘤之首[1]，盡管早期診斷可以提高生存率，但僅有約15%患者能在早期獲得診斷[2]，絕大部分患者就診時就已經處于晚期階段。蛋白質精氨酸甲基轉移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)能夠特異性催化組蛋白及非組蛋白等底物的對稱性甲基化[3]，從而影響多個靶基因及多條信號通路，發揮眾多生物學功能[4-5]。研究表明，PRMT5在多種惡性腫瘤如淋巴瘤[6]、膠質瘤[7]、乳腺癌[8]和白血病[9]等中呈高表達，且其高表達與腫瘤惡化及患者預后相關。我們前期研究發現，上調PRMT5表達可以促進卵巢癌細胞生長和增殖[10]。然而，PRMT5對卵巢癌細胞功能影響的具體機制仍不清楚。因此，本研究旨在探討PRMT5表達與卵巢癌細胞上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)之間的關系及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人卵巢癌HO8910細胞株為本實驗室長期保存；多西環素(doxycycline，Dox)誘導型穩定敲低PRMT5的HO8910細胞株用pLKO-Tet-puro慢病毒誘導型載體構建，構建方法參考文獻[11]。

1.1.2 主要試劑和儀器 骨架載體pLKO-Tet-On、pHR-CMV-8.2ΔVPR、pHR-CMV-VSVG以及pLKO-Tet-On-SC、pLKO-Tet-On-PRMT5、pCMV-Myc、pCMV- Myc-PRMT5質粒由美國普渡大學胡長燈教授惠贈。兔抗人PRMT5多克隆抗體，兔抗人α-微管蛋白單克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG抗體購自美國 Bioworld 公司；基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP2)、波形蛋白、N-鈣黏蛋白和E-鈣黏蛋白抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；聚凝胺、Dox和嘌呤霉素(美國 Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 2000試劑(美國 Invitrogen公司)；熒光定量PCR試劑盒，RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒(日本 TaKaRa 公司)；PVDF膜和ECL顯影試劑(美國Millipore公司)。

核酸測定儀Biomate 3s(美國Thermo Scientific公司)；Mx3000p Real Time PCR擴增儀(美國Stratagene公司)；Alpha化學發光凝膠成像系統Fluor Chem FC3(美國Protein Simple公司)；倒置顯微鏡BX51(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 H08910細胞株培養于含10%新生胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合液的DMEM中，37 ℃、5%CO2培養，常規傳代。

1.2.2 PRMT5 shRNA干擾質粒構建 pLKO-PRMT5-shRNA質粒和對照質粒pLKO-Tet-On-SC的構建參照文獻[12]。PRMT5-shRNA引物序列：上游5′-GCCCAGTTTGAGATGCCTTAT-3′，下游5′-CCCATCCTCTTCCCTATTAAG-3′。

1.2.3 HO8910細胞株中敲低PRMT5的效率驗證 實驗分為pLKO對照組(感染空載體慢病毒)、pLKO+Dox(100 ng/mL)組、shPRMT5組(感染PRMT5 shRNA 慢病毒)和shPRMT5+Dox(100 ng/mL)組；將處于對數生長期的HO8910細胞接種于6 cm培養皿，孵育12～24 h；換液加入3 mL DMEM和1 mL病毒液(2.0 μg pLKO-Tet-On-SC、2.0 μg pLKO-Tet-On-PRMT5)，混勻后加入8 μg/mL 聚凝胺感染細胞，孵育24 h；再重復上述步驟1次；用2.0 μg/mL 嘌呤霉素篩選72 h；再用含1.0 μg/mL嘌呤霉素培養基維持培養，直至篩選出穩定感染PRMT5- shRNA的HO8910細胞株(shPRMT5)；最后，用終質量濃度為100 ng/mL Dox誘導培養48 h；用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)和免疫印跡法分別檢測PRMT5 mRNA和蛋白表達水平。

1.2.4 HO8910細胞株中PRMT5過表達的效率驗證 將處于對數生長期的HO8910細胞分為空白對照組(野生型HO8910細胞株)、陰性對照組(轉染pCMV-Myc質粒)、實驗組(轉染pCMV-Myc-PRMT5質粒)，接種于6 cm培養皿，孵育12 h；將2.0 μg pCMV-Myc-vector(對照)和2.0 μg pCMV-Myc-PRMT5質粒用Lipofectamine2000轉染HO8910細胞48 h；免疫印跡法用Myc檢測各組Myc-PRMT5表達，qRT-PCR檢測各組細胞PRMT5mRNA表達水平。

1.2.5 qRT-PCR法檢測PRMT5 mRNA表達 取“1.2.3”和“1.2.4”分組細胞，按照RNA提取試劑盒操作手冊提取細胞總RNA，并用紫外分光光度法測定RNA純度和濃度。采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，采用熒光定量試劑盒進一步行PCR擴增。PRMT5基因(NM_001282953.1)引物序列：上游5′-GTTTGAAGAATGGGGAAGCCAAGTG-3′，下游5′-GAGCCAGAAAGGAAGTGTACTCC-3′；以GAPDH基因(NM 001256799.1)為內參照，引物序列：上游5′-GCAAATTCCATGGCACCGTC-3′，下游5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。基因的相對表達量用2-ΔΔCt值表示。實驗重復3次。

1.2.6 免疫印跡法檢測PRMT5和EMT相關蛋白表達 收集穩定敲低和順時轉染過表達PRMT5的HO8910細胞，實驗分為shPRMT5+Dox組(誘導感染PRMT5 shRNA 慢病毒)、shPRMT5組(未誘感染PRMT shRNA慢病毒)、PCMV-Myc組(未過表達PRMT5)和pCMV-Myc-PRMT5組(過表達PRMT5的HO8910細胞株)，用預冷PBS 洗2次；加入 200 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液，置于冰上處理 20 min；以12 000 r/min，4 ℃離心15 min；取上清液即為總蛋白。各取50 ng總蛋白用分離膠濃度為8%～12%的SDS-PAGE分離蛋白(80 V電壓30 min，110 V電壓100 min)；轉移至PVDF膜，300 mA恒流120～150 min；用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；加入對應一抗E-鈣黏蛋白、波形蛋白、N-鈣黏蛋白和MMP2，均1∶500，α-微管蛋白單克隆抗體(1 ∶5 000)，4℃孵育過夜；次日，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h；經ECL顯影，用Image J軟件定量。實驗重復3次。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 按照參考文獻[13]，實驗分組同“1.2.6”，將細胞制備成不含血清的細胞懸液，每個Transwell小室上室接種1.5×105個HO8910細胞，下室加入500 μL含血清的DMEM，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h；用棉簽擦拭膜上表面未遷移的細胞，遷移至下表面的細胞用4%多聚甲醛固定30 min；結晶紫染色液室溫染色15 min；顯微鏡觀察染色細胞。每個Transwell小室隨機取5個視野，計數染色細胞，相對遷移率=轉移細胞數/Transwell小室總細胞數。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 誘導型穩定敲低PRMT5的HO8910細胞株的效率驗證

免疫印跡結果顯示，與shPRMT5對照組比較，shPRMT5+Dox組HO8910細胞中PRMT5蛋白表達顯著減少(t=4.927，P<0.05)；pLKO+Dox組PRMT5蛋白表達水平與pLKO對照組比較差異無統計學意義(t=1.208，P>0.05)。qRT-PCR結果同樣顯示，shPRMT5+Dox組PRMT5 mRNA表達較pLKO對照組、pLKO+Dox組、shPRMT5組顯著減少(t=8.71，7.861，8.131，P均<0.01)。見圖1。

2.2 PRMT5過表達效率驗證

免疫印跡結果顯示，空白對照組和陰性對照組均無標簽蛋白Myc表達，而實驗組檢測到Myc表達。qRT-PCR結果顯示，實驗組PRMT5 mRNA表達水平顯著高于空白對照組和陰性對照組(t=39.547，37.813，P均<0.01)。見圖2。

2.3 PRMT5對卵巢癌HO8910細胞遷移的影響

Transwell結果顯示，與shPRM5對照組比較，shPRMT5+Dox實驗組中卵巢癌HO8910細胞遷移率顯著減少(t=4.157，P<0.05)；pCMV-Myc-PRMT5組中HO8910細胞遷移率顯著高于pCMV-Myc組(t=3.261，P<0.05)。見圖3。

圖1 免疫印跡和qRT-PCR驗證HO8910細胞中PRMT5基因敲低的效率

圖2 免疫印跡和qRT-PCR驗證HO8910細胞中PRMT5基因過表達效率

圖3 Transwell實驗檢測PRMT5過表達或敲低后細胞的遷移能力(結晶紫染色×200)

2.4 PRMT5敲低后EMT相關蛋白的表達

免疫印跡結果顯示，與shPRMT5組相比，shPRMT5+Dox組HO8910細胞中PRMT5表達和間質標志分子MMP-2、波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達顯著降低(P<0.01或<0.05)，而上皮標志分子E-鈣黏蛋白表達顯著增加(t=17.527，P<0.01)。見圖4。

1:shPRMT5組，2：shPRMT5+Dox組；a：P<0.05，b：P<0.01，與shPRMT5組比較

2.5 PRMT5過表達后EMT相關蛋白的表達

免疫印跡結果顯示，與pCMV-Myc組相比,pCMV-Myc-PRMT5組HO8910細胞中Myc表達、MMP-2、波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達顯著升高(P<0.01或<0.05)，而E-鈣黏蛋白表達顯著降低(t=18.306，P<0.05)。見圖5。

1:pCMV-Myc組；2:pCMV-Myc-PRMT5組；a：P<0.05，b：P<0.01，與pCMV-Myc組比較

3 討論

EMT是上皮細胞轉化為間質細胞的過程，它賦予細胞轉移和入侵的能力，與腫瘤的發生發展進程相關[14]。EMT表現為細胞黏附能力喪失，E-鈣黏蛋白表達下降，間質標志物和纖維連接蛋白表達上升，細胞運動能力和侵襲能力增強。研究報道[15]，PRMT5協同MEP50/WDR77復合物通過表觀遺傳調控作用誘導EMT進程，從而促進肺癌細胞侵襲和遷移。本研究采用卵巢癌HO8910細胞株，通過免疫印跡法和Transwell小室實驗證實PRMT5促進卵巢癌細胞EMT進程，并增強細胞遷移能力。

細胞增殖與腫瘤發生發展密切相關，本課題組前期發現[10]，PRMT5對卵巢癌細胞的增殖有重要的調控作用，下調PRMT5可抑制HO8910細胞克隆形成，減低細胞DNA復制能力，并抑制細胞增殖；過表達PRMT5則相反，提示PRMT5可能作為一個潛在的致癌基因促進卵巢癌的發生發展。本研究發現下調PRMT5表達可以抑制卵巢癌HO8910細胞遷移，而過表達PRMT5則促進細胞遷移。

E-鈣黏蛋白表達缺失或降低與腫瘤轉移密切相關，在小鼠模型中證實E-鈣黏蛋白缺失顯著增強癌細胞侵入健康組織的能力[16]。本研究發現，敲低PRMT5可以促進上皮標志分子E-鈣黏蛋白表達，而PRMT5過表達則反之，由此表明PRMT5與細胞遷移密切相關。此外，外源表達PRMT5后，間質標志分子MMP-2、波形蛋白和N-鈣黏蛋白表達上調，并促進HO8910細胞遷移，提示PRMT5可能通過EMT依賴的方式調控卵巢癌細胞遷移。

綜上，PRMT5在卵巢癌細胞遷移中發揮重要作用，其可促進卵巢癌細胞的 EMT進程及細胞遷移。然而，PRMT5對EMT轉化過程的調控作用是否與表觀遺傳修飾有關，以及在體內卵巢腫瘤的轉移中是否有相同的作用仍需進一步研究。