白芍總苷對大鼠球囊損傷再狹窄的作用及機制研究*

羅特丹，姜昕，周沖沖，李鵬

（深圳市人民醫院 老年病科，廣東 深圳 518020）

隨著中國老齡化程度的加速，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）的患病率及病死率逐年增加。經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention, PCI）通過開通狹窄冠狀動脈能明顯降低冠心病患者的病死率，改善預后，因此在臨床中得到廣泛的應用，但發生術后再狹窄仍然是影響PCI 療效的重要原因。有研究表明，PCI 造成損傷血管局部炎癥反應是術后再狹窄的根本原因，而Th17 和Treg 細胞免疫失衡引起的炎癥失控在多種疾病中扮演著重要角色，但是否在再狹窄的發生、發展中發揮作用尚無相關報道[1-3]。白芍總苷作為臨床中被廣泛應用的非特異性抗炎藥能否通過調節Th17 和Treg 細胞的凋亡，發揮抑制PCI 術后再狹窄的作用亦無相關研究。如今藥物涂層球囊在PCI 中占據一席之地，有研究顯示，藥物球囊與第二代洗脫支架相比在治療再狹窄方面無明顯區別[4]。

本實驗旨在通過復制大鼠頸動脈球囊損傷模型，應用藥物浸泡球囊方法模擬藥物涂層球囊，研究白芍總苷干預前后Th17、Treg 細胞數量及內膜的變化，為治療再狹窄尋找新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

SPF 級14 ～16月齡雄性SD 大 鼠[SCXK（粵）2019-0035]36 只由廣東省醫學實驗動物中心提供。Th17 和Treg 細胞檢測試劑盒購自美國eBioscience 公司，白芍總苷購自寧波立華制藥有限公司（批號： H20055058）。

1.2 方法

1.2.1 復制大鼠頸動脈球囊損傷模型36 只大鼠被隨機、等量分成對照組、球囊損傷組、白芍總苷浸泡球囊組及白芍總苷灌胃組，每組9 只。各組大鼠模型復制前4 d 用生理鹽水灌胃，20 ml/d，白芍總苷灌胃組用200 mg/（kg·d）白芍總苷生理鹽水灌胃，20 ml/d。各組大鼠模型復制前12 h 皮下注射低分子肝素，球囊浸泡組的球囊浸泡于5 g/L 白芍總苷生理鹽水4 h。各組術前麻醉后，在左頸總動脈靠心臟一端阻斷血流，切開頸外動脈。對照組做假手術，只結扎頸外動脈再縫合切口。其余組復制球囊損傷模型： 用規格2.0 mm×10.0 mm 的Medtronic 球囊導管從切口處插入至頸總動脈約1.5 cm，用200 kPa 壓力充盈球囊，向遠離心臟一端拖拉導管，剝脫動脈內膜，抽除氣體后，再送向近心臟一端，如此重復3 次，移去導管，結扎切口，去掉頸總動脈血管夾，恢復阻斷血流，縫合傷口。術后24 h 再次皮下注射低分子肝素預防血栓。術后肌內注射青霉素3 d 預防感染。術后白芍總苷灌胃組用200 mg/（kg·d）白芍總苷生理鹽水灌胃，20 ml/d，共13 d，其余組用生理鹽水灌胃，20 ml/d，共13 d。模型復制過程中由于損傷嚴重死亡5 只，標本取材時因發現血栓導致頸總動脈栓塞而剔除1只。最終納入實驗共30只，對照組、球囊損傷組、白芍總苷灌胃組及白芍總苷浸泡球囊組分別為9、6、7 和8 只。

1.2.2 指標檢測①標本取樣： 術后14 d，在麻醉下取各組大鼠左頸總動脈球囊損傷部位，長度約1.5 cm，以2 根血管作為1 個樣本。取0.5 cm 長的損傷血管置于4%多聚甲醛中固定，制成石蠟標本。每個標本按距心臟近、中及遠端連續切4μm 厚的切片10 張，蘇木精-伊紅染色后，用顯微鏡觀察動脈管腔變化。取大鼠脾臟用于流式細胞儀分析。②病理學檢測血管內膜變化： 應用Quantiment 520 型計算機圖像分析儀分別測量各組血管的管腔、內膜及中膜橫斷面面積[5]。③流式細胞儀檢測Th17、Treg 細胞分別占CD4+T 細胞的百分比： 無菌分離大鼠脾臟，使用無菌注射器活塞部分研磨脾臟，細胞過濾器上過濾，離心后去上清，制成單細胞懸液，調整細胞濃度至2×107個/ml，將100μl 細胞懸液加入流式管中，標記細胞外標熒光抗體（CD3 PE-Cy5、CD4-FITC 及CD25 PE-CY5.5），混勻后4℃避光孵育30 min，加染色緩沖液2 ml 后離心洗滌2 次，棄上清液，加入固定穿膜液1 ml 后4℃避光孵育30 min 進行穿膜。加入穿膜緩沖液2 ml 離心洗滌2 次后棄上清，加入流式內標熒光抗體（PE標記的Foxp3，APC-CY7 標記的IL-17A）4℃避光孵育30 min，用穿膜緩沖液洗2 ml 離心洗滌2 遍后棄上清，加入染色緩沖液，流式細胞儀檢測并分析Th17（CD3+CD4+IL-17A+）及Treg（CD4+CD25+Foxp3+）的比例，應用Flowjo 7.6.1 軟件分析數據。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組主動脈內膜增生程度比較

各組管腔面積、內膜面積及內膜面積/中膜面積比值比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。對照組內膜光滑無增厚，僅由一層扁平的血管內皮細胞組成；球囊損傷組新生內膜形成導致內膜增厚，新生內膜主要由大量增殖的血管平滑肌（vascular smooth muscle, VSM）細胞構成，增生的VSM 細胞排列無序紊亂，管腔面積較對照組小，內膜面積及內膜面積/中膜面積比值較對照組大（P＜0.05）；白芍總苷灌胃組新生內膜較球囊損傷組薄，管腔狹窄程度較球囊損傷組明顯減輕，管腔面積較球囊損傷組大，內膜面積及內膜面積/中膜面積比值較球囊損傷組小，但高于對照組（P＜0.05）。白芍總苷浸泡球囊組內膜較白芍總苷灌胃組薄，增生的VSM 細胞較白芍總苷灌胃組少，管腔面積較白芍總苷灌胃組大，內膜面積及內膜面積/中膜面積比值較白芍總苷灌胃組小，但高于對照組（P＜0.05）。見表1和圖1。

表1 各組主動脈內膜增生程度比較 （±s）

表1 各組主動脈內膜增生程度比較 （±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與球囊損傷組比較，P ＜0.05。

組別 n 管腔面積/mm2 內膜面積/mm2 中膜面積/mm2 內膜面積/中膜面積對照組 9 0.846±0.012 0.033±0.028 0.343±0.013 0.085±0.011球囊損傷組 6 0.472±0.016① 0.481±0.017① 0.331±0.013① 1.436±0.048①白芍總苷灌胃組 7 0.634±0.014①② 0.254±0.015①② 0.343±0.021①② 0.753±0.014①②白芍總苷浸泡球囊組 8 0.735±0.016①② 0.188±0.012①② 0.363±0.015①② 0.543±0.033①②F 值 5.741 4.853 1.165 4.519 P 值 0.008 0.017 0.133 0.022

圖1 各組頸動脈球囊損傷后的病理切片 （HE 染色×400）

2.2 各組Th17、Treg 占CD4+T 細胞的百分比及Th17/Treg 比較

各組Th17、Treg 占CD4+T 細胞的百分比及Th17/Treg 比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。球囊損傷組Th17 占CD4+T 細胞的百分比、Th17/Treg 高于白芍總苷灌胃組、白芍總苷浸泡球囊組及對照組（P＜0.05）；且白芍總苷浸泡球囊組低于白芍總苷灌胃組，而高于對照組（P＜0.05）。白芍總苷灌胃組Treg 占CD4+T 細胞的百分比高于球囊損傷組及對照組（P＜0.05），且白芍總苷浸泡球囊組高于白芍總苷灌胃組（P＜0.05）。見表2和圖2、3。

表2 各組Th17、Treg 占CD4+T 細胞的百分比及Th17/Treg 比較 （%，±s）

表2 各組Th17、Treg 占CD4+T 細胞的百分比及Th17/Treg 比較 （%，±s）

注： ①與對照組比較，P ＜0.05；②與球囊損傷組比較，P ＜0.05；③與白芍總苷灌胃組比較，P ＜0.05。

組別 n Th17 占CD4+ T 細胞百分比 Treg 占CD4+ T 細胞百分比 Th17/Treg對照組 9 0.27±0.05 0.33±0.06 0.79±0.10球囊損傷組 6 1.24±0.07① 0.52±0.07① 2.52±0.12①白芍總苷灌胃組 7 1.02±0.06①② 0.88±0.08①② 1.28±0.08①②白芍總苷浸泡球囊組 8 0.87±0.06①②③ 1.05±0.08①②③ 0.91±0.11①②③F 值 5.274 4.526 4.381 P 值 0.018 0.023 0.026

圖2 各組大鼠脾臟中Th17 細胞比例

圖3 各組大鼠脾臟中Treg 細胞比例

3 討論

PCI 術后血管再狹窄的過程實質上是血管對損傷所致炎癥反應的修復過程，PCI 所致局部內皮細胞損傷及功能障礙誘發的炎癥反應釋放多種炎癥細胞因子，促進VSM 細胞分化、增生并向損傷部位移行，使血管重建最終導致再狹窄，因此可以認為炎癥是再狹窄的始發因素[6]。

有研究顯示，各種導致動脈粥樣硬化的危險因素均可引起血管內Th17 細胞的增加，由Th17 細胞分泌的IL-17A 能介導白細胞黏附于血管內皮之上，最終促進炎癥的發展[7-9]。有研究發現球囊損傷能通過激活核轉錄因子-κB（NF-κB）途徑引起IL-17A 的大量分泌，并作用于VSM 細胞，致使球囊損傷后局部管腔狹窄，間接表明Th17 細胞增多在再狹窄中占有重要的地位[5]。筆者發現球囊損傷后損傷血管內膜面積與Th17 細胞比例相關，表明球囊損傷可使Th17 細胞數量增加并促進VSM 細胞向損傷部位的遷移及增殖，最終引起管腔狹窄。其機制可能是局部損傷所致Th17 細胞大量激活，Th17 通過NF-κB 途徑引起IL-17A、IL-6 等促炎因子的分泌，產生局部炎癥瀑布，使炎癥進一步擴大，最終導致血管內膜增厚。

Treg 細胞是一類對慢性炎癥疾病具有重要保護作用的T 細胞亞群，能通過分泌如IL-10 等抑制炎癥的細胞因子及抑制效應T 細胞的增殖，達到抑制炎癥的效果[10]。Treg 細胞可通過抗巨噬細胞和血管內皮細胞炎癥活性而抑制動脈粥樣硬化的發展[11]。多項臨床試驗表明，動脈粥樣硬化性疾病與各種信號通路介導的細胞凋亡途徑引起Th17/Treg 細胞失衡相關[12-13]。而Th17/Treg 失衡，將導致免疫失衡，并引起一系列炎癥反應。筆者發現球囊損傷后Treg 細胞比例較對照組明顯增加，且Treg 細胞比例與球囊損傷后管腔面積相關，考慮球囊損傷引起局部炎癥，機體通過上調Treg 細胞比例抑制IL-6 等炎癥因子進一步產生，并促進IL-10 等抑炎因子的分泌，避免球囊損傷造成的炎癥反應的級聯擴大而抑制再狹窄。并且隨著炎癥的擴大，通過負反饋機制使Treg 細胞激活增多，但由于Treg 細胞增多所產生的抑炎效果不足以完全抵消由于Th17 細胞增多所帶來的促炎效果，最終球囊損傷引起的局部炎癥反應所致再狹窄仍不可避免發生，這從球囊損傷后Th17 細胞的變化幅度較Treg 細胞變化幅度大中得以證實。因此糾正球囊損傷后Th17/Treg 細胞失衡在阻止再狹窄的發生中具有重要意義。

白芍總苷是從中藥白芍中提取出的有效成份，是目前臨床廣泛應用的一種免疫調節劑。有研究報道白芍總苷能通過抑制NF-κB 等通路減少Th17 細胞分化，最終減輕炎癥導致的臨床癥狀[14]。LIN 等[15]研究發現，白芍總苷能通過降低Foxp3基因啟動子區域甲基化水平及脫甲基作用，促進Foxp3 的表達，提高Treg 占CD4+T 細胞的百分比。有實驗發現，白芍總苷能通過調節Th17/Treg 細胞平衡達到治療炎癥性疾病的目的[16-17]。本研究中無論是應用灌胃的方法使白芍總苷作用于全身，還是應用球囊浸泡的方法使白芍總苷作用于局部，在降低球囊損傷后脾臟Th17 細胞水平的同時還能提高Treg 細胞水平，使Th17/Treg 降低，且Th17/Treg 與狹窄程度及VSM 細胞增生程度相關。提示白芍總苷能通過上述信號途徑負向調節球囊損傷后大鼠Th17/Treg 細胞平衡，發揮抗炎和免疫調節的作用，達到抑制再狹窄的目的。本研究中白芍總苷上調Treg 細胞的能力較下調Th17 細胞明顯，可能是白芍總苷先通過上調Treg 細胞至一定程度后，再通過Th17/Treg 免疫系統負向調節Th17 細胞的分化。而且還發現，應用白芍總苷浸泡球囊的方法，同樣能調節Th17/Treg 細胞免疫失衡，以達到抑制球囊損傷后再狹窄的目的，且效果好于白芍總苷灌胃。結果提示可將白芍總苷作為藥物球囊涂層局部使用，其較全身使用能更好地抑制球囊損傷后的再狹窄，且無明顯不良反應。考慮其原因為局部使用白芍總苷較全身使用時損傷部位白芍總苷濃度更高，故能更好地調節Th17/Treg 細胞免疫失衡而抑制炎癥。但無論應用何種方法干預，對照組管腔面積最大，考慮白芍總苷雖然能通過調節Th17/Treg 細胞免疫失衡減少炎癥的進一步擴大，但并不能完全消除炎癥引起的VSM 細胞增生。

目前已經進入藥物洗脫支架時代，但因支架的金屬網格殘留特點仍可導致再狹窄的發生。且在多項研究中藥物洗脫支架仍有爭論，一項關于現階段使用的藥物洗脫支架安全性的薈萃分析發現，對比金屬裸支架，藥物洗脫支架有更多的晚期血栓風險[18]。因此無論從臨床上還是社會經濟學方面考慮都迫切需要尋找一種新的藥物，以減少再狹窄的發生。白芍總苷或可作為球囊的藥物涂層應用于PCI 術中，通過調節Th17/Treg 細胞免疫失衡，抑制炎癥介導的VSM 細胞的增殖及向損傷部位的遷移，減少支架內內膜增生，達到減少再狹窄發生的目的，因此期待通過大規模臨床試驗來驗證白芍總苷作為藥物球囊的涂層，減少PCI 術后再狹窄的發生。