呼腸孤病毒空斑檢測方法建立

竇麗麗，陶曉莉，李婷婷，李藤菲，林家鋒，李永剛

呼腸孤病毒之前是從人和動物的呼吸道或腸道中分離出來的。 它被稱為呼吸(R)，腸(E)，孤兒(O)病毒，是因為病毒的發病機制尚不清楚，簡稱為呼腸孤病毒[1]。 在呼腸孤病毒科內，正呼腸孤病毒屬包括感染爬行動物，鳥類和哺乳動物(包括人類)的病毒。正呼腸孤病毒分為幾個亞組：第1個亞組包括哺乳動物正呼腸孤病毒(MRV); 第2個亞組包括禽呼腸孤病毒(ARV)以及從果蝠中分離出的納爾遜海灣病毒(NBV); 第3個亞組包括從狒拂體內分離到的呼腸孤病毒(Baboon reovirus, BRV)[2]。正呼腸孤病毒包含一種由內層和外層組成的雙層蛋白衣殼，正呼腸孤病毒內衣殼層加上其封閉的病毒基因組通常被稱為病毒核心。病毒基因組由線性雙鏈RNA(dsRNA)組成，分為3個大片段(L1、L2、L3)，3個中片段(M1、M2、M3)，4個小片段(S1、S2、S3、S4)[3]。本文研究的方向是NBV。NBV 最初從澳大利亞果蝠中分離出來，超過 40 年的時間以獨立形式存在，且不與任何疾病發生關聯。然而，最近已證實幾種NBV病毒株是人呼吸道感染的病原體，并且從一些患有急性呼吸道疾病的患者體內分離的病原體已經表明NBV已經演變成可以在人類中傳播的一種人獸共患病[4-9]。2007年，日本學者將NBV從印度尼西亞巴厘島返回日本的患有急性呼吸道感染的患者中分離出來，并命名為Miyazaki-Bali/2007(MB)[10-11]。致病性NBV能引起人類急性呼吸道及腸道炎癥，并且在東南亞地區呈逐步漫延的趨勢。NBV感染者可出現流感樣癥狀如發熱、咳嗽和咽喉炎等[4,8,11-13]，也可出現腹痛、水樣腹瀉和嘔吐的癥狀[12]。納爾遜海灣正呼腸孤病毒是一種具有未知人獸共患潛力的融合蝙蝠病毒[1,14-16]。以前的研究表明，NBV可以感染和復制來自其天然宿主(蝙蝠)以及人類，小鼠和猴子的各種細胞類型。在這些細胞內，NBV誘導顯著的細胞病變效應，其特征在于細胞-細胞融合和合胞體形成[17-18]。對NBV致病機制的研究需對NBV-Miyazaki病毒株的滴度進行定量測定?？瞻咝纬稍囼炞鳛闇y定病毒滴度的金標準已經得到廣泛的應用,但是有些方法不易形成空斑，因此通過本實驗建立了空斑檢測方法，為進一步研究呼腸孤病毒病毒所需進行的滴度檢測打下了基礎。

1 材料與方法

1.1材料 L929細胞由錦州醫科大學病原生物學實驗室常規傳代保存；BSR細胞、NBV-Miyazaki病毒株由日本大阪大學饋贈。DMEM培養基、青鏈霉素均購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Hyclone公司；0.25%胰酶和中性紅染色液均購自Sigma公司；Mouse Anti-β-actin mAb購自北京中杉金橋公司；BactoTMAgar購自美國Becton, Dickinson and Company；NP-40裂解液購自上海碧云天公司；蛋白酶抑制劑(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)、4×蛋白上樣緩沖液均購自北京索來寶科技有限公司；6×loading buffer購自大連寶生物公司；瓊脂糖購自北京百晶生物技術有限公司；Trizol·ls、HRP-goat anti-mouse IgG (H+L)、Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG均購自Invitrogen公司；抗體NBV S3由錦州醫科大學病原生物學實驗室制備。

1.2方 法

1.2.1Western Blot檢測目的蛋白 試驗分兩組：空白對照組(不感染病毒)和實驗組(感染病毒)，每組2個孔。L929細胞8×105細胞/孔鋪6孔板，待細胞貼壁后，PBS洗3遍，NBV-Miyazaki病毒株感染細胞(對照組加PBS)，置于培養箱培養1 h，PBS洗3遍，DMEM高糖培養基(含5% FBS、1%青鏈霉素)培養24 h。除去培養基，用PBS洗滌細胞3次，并在含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的NP-40 buffer中裂解。將蛋白質裂解物與4×蛋白上樣緩沖液混合，然后106 ℃變性10 min，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并使用半干轉移系統(Bio-Rad，USA)轉移到PVDF膜上。用NBV S3(經ELISA檢測，效價達1∶64 000)作為一抗，HRP-goat anti-mouse IgG (H+L)作為二抗檢測目的蛋白是否存在。

1.2.2NBV-Miyazaki病毒感染細胞進行免疫熒光測定 用實驗室保存的NBV-Miyazaki病毒株感染BSR細胞在24孔板中培養，PBS洗掉培養基，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3遍，0.1% Triton-100室溫打孔10 min，洗掉后用PBS洗3遍，2% FBS封閉1 h，選擇一抗NBV S3，1∶250倍稀釋,37 ℃孵育1 h;PBS洗3遍；二抗為Alexa Flour 594 goat anti-mouse IgG，進行1∶500倍稀釋，37 ℃避光孵育1 h。PBS洗3遍，洗最后1遍時保留PBS。使用免疫熒光顯微鏡進行觀察和拍攝。

1.2.3NBV-Miyazaki病毒核酸電泳分析 提病毒RNA：病毒加Trizol·l s,靜置5 min；加入氯仿，顛倒混勻，靜置5 min；12 000 r/min離心15 min；棄上清，80%乙醇洗1次，12 000 r/min離心2 min；棄上清，室溫干燥5～10 min；加10 μL RNase-Free水。加6×Loading Buffer，混勻，加樣，進行水平凝膠電泳。然后紫外照相。

1.2.4空斑形成試驗測定NBV-Miyazaki病毒滴度 L929細胞經0.25%胰酶消化后，以(0.8 ～ 1)×106個/孔鋪12孔板，37 ℃，5% CO2條件下培養24 h。以未感染Miyazaki的細胞作為空白對照。共5個稀釋度將病毒樣品進行10倍梯度稀釋，做2次重復，每個稀釋度按圖4進行接種，每孔250 μL病毒液，37 ℃，5% CO2條件下孵育，間隔 15 min搖晃1次；1 h后，吸去病毒液，將于37 ℃預熱的含 5%胎牛血清的DMEM培養液與2.4% BactoTMAgar以2∶1的比例混勻，每孔加入2 mL混合物，待細胞板中覆蓋物凝固后，倒置，37 ℃，5% CO2條件下培養，觀察并記錄細胞形成典型融合病變即空斑的時間、形態和數量。病毒感染細胞7 d后，每孔加入1 mL中性紅染色液與培養基、BactoTMAgar的混合物，于 5% CO2、37 ℃培養過夜；次日，加入1 mL 4%甲醛固定細胞于冰箱固定一夜，棄去上層覆蓋物，觀察空斑形態，記錄空斑數，并按下式計算病毒滴度。 病毒滴度(PFU/mL)=(每孔平均空斑個數×病毒稀釋度倒數)/每孔病毒接種量(mL)。

2 結 果

2.1Western Blot檢測NBV S3蛋白 通過Western Blot實驗顯示，結果如圖1，經NBV-Miyazaki病毒感染的兩組均能檢測到病毒非結構蛋白NBV S3，未經感染的兩組未能檢測到蛋白。

圖1 Western Blot檢測NBV S3蛋白Fig.1 Western Blot detection of NBV S3 protein

2.2免疫熒光檢測NBV-Miyazaki病毒感染細胞 免疫熒光顯示經NBV-Miyazaki病毒感染的細胞有紅色熒光表達，未感染病毒的細胞未檢測到非特異性的熒光標記。見圖2。

圖2 免疫熒光檢測病毒感染細胞(×200)Fig.2 Immunofluorescence detection of virus-infected cells (×200)

2.3NBV-Miyazaki病毒核酸電泳分析 為了驗證NBV-Miyazaki病毒中核酸的成分，采用病毒RNA水平凝膠電泳。結果如圖3，病毒所含核酸為具有大中小3類共10段雙鏈 RNA(dsRNA)：大基因組(L1、L2、L3)，中基因組(M1、M2、M3)和小基因組(S1、S2、S3、S4)。

圖3 NBV-Miyazaki病毒核酸電泳分析Fig.3 NBV-Miyazaki virus nucleic acid electrophoresis analysis

2.4用本實驗方法的空斑形成試驗測定NBV-Miyazaki病毒滴度 L929細胞接種 10 倍比稀釋病毒液加入覆蓋物7 d后，每孔加入1 mL中性紅染色液與培養基、膠的混合物，于5% CO2、37 ℃培養過夜；次日，加入 1 mL 4%甲醛固定細胞，于冰箱固定一夜，棄去膠，結果如圖4，觀察空斑形態，記錄空斑數，并按下式計算病毒滴度。 病毒滴度(PFU/mL)=(每孔平均空斑個數×病毒稀釋度倒數)/每孔病毒接種量(mL)。病毒滴度為 2.2×108PFU/mL。未被病毒感染發生細胞病變區域的區域，被中性紅染成紅色；被病毒感染發生細胞病變處，不能被中性紅染色，呈現為無色空斑。肉眼可見：空斑呈圓形或類圓形，在12孔板內散在分布，空斑較多時可以與鄰近空斑形成融合現象。顯微鏡下可觀察到形成空斑處，細胞脫落；而未形成空斑處，細胞存留。

Note:A: blank control; B ～ F: virus dilution is 10-4-10-8圖4 NBV-Miyazaki病毒空斑測定結果Fig.4 NBV-Miyazaki virus plaque assay results

3 討 論

正呼腸孤病毒屬廣泛存在于自然界的生物中，可從多種生物體內分離，但大部分生物感染該病毒后無明顯體征[19]，且對人的致病性無法確定。納爾遜海灣正呼腸孤病毒作為膜融合正呼腸孤病毒，最近被證實[4,7]， 它可以從患有急性呼吸道疾病的患者中分離出來，并且這種致病性呼腸孤病毒的分離引起人們對潛伏的呼腸孤病毒傳播疾病的關注。正呼腸孤病毒根據在細胞中誘導細胞的能力分為促融合正呼和非促融合正呼[20]，該病毒因含有獨特的RNA多聚酶，在宿主體內可利用自身 RNA 逆轉錄酶合成的新mRNA作為新RNA和病毒蛋白質合成的模板[21]。病毒在復制正鏈基礎上，通過自身RNA多聚酶翻譯成蛋白，合成負鏈，形成雙鏈RNA分子，此后，雙鏈RNA 與蛋白外殼重新組裝，形成新的病毒粒子，致細胞破裂，在宿主體內產生大量病毒[22]。

本實驗所用的NBV-Miyazaki病毒株經過Western Blot實驗、免疫熒光檢測病毒感染細胞驗證了是可以感染細胞的，具有病毒毒力；同時進行了病毒RNA垂直電泳驗證了NBV-Miyazaki病毒株的核酸成分是符合正呼腸孤病毒的基因組成分的。本實驗改進的空斑形成試驗準確測定出了NBV-Miyazaki病毒株的滴度，為應用此病毒株進行后續實驗提供理論基礎。滴度測定可以讓我們知道病毒顆粒的含量，這對于之后的MOI實驗是很方便的。這樣就不會因為滴度過低而導致轉染成功率降低，也不會因為滴度過高而浪費病毒或者引起宿主細胞的死亡。

在用本文方法之前進行了幾次空斑形成實驗。所用培養基為2×DMEM培養基，為500 mL高壓后超純水所溶解的DMEM粉末，按照說明加入碳酸氫鈉，調節pH至7.2，與2.4%濃度的BactoTMAgar以1∶1的比例混合均勻。余下步驟均與空斑形成實驗方法相同。但重復此方法幾次結果均不佳。1×DMEM培養基與2.4%濃度的BactoTMAgar以1∶1的比例混合、2×DMEM培養基與2.4%濃度的BactoTMAgar以2∶1的比例混合均效果不佳。但用本文所述1×DMEM培養基與BactoTMAgar 2∶1混合所得結果如圖4，空斑清晰可見。用將目前已知的幾種測定病毒滴度的方法進行比較，其中TCID50法限制較多，不容易觀察，而空斑法易于觀察和計數；FFU法(間接免疫熒光法)需要抗體等，所耗費用較多、成本較高，但空斑法耗費較少、節約成本；CMC(羧甲基纖維素鈉)法不容易得到結果，方法不成熟，而空斑法適用于大多數病毒，有著大量的報道和研究；細胞病變法觀察結果主觀因素大, 而空斑法較為客觀，細胞病變法以陽性結果作為判定, 病變程度判定不準確, 空斑法以斑數判定結果較準確。本實驗建立的空斑檢測方法，對于測定呼腸孤病毒滴度較為準確?？瞻咴囼炇菧y定病毒滴度的經典方法,說服力強，已經有多個文獻報道和記載。每一個空斑代表一個感染性病毒顆粒的繁殖，被破壞的死細胞不能被染色從而呈現白斑。該方法簡單、經濟、方便，可準確計算出病毒感染的單位數量，可用于基礎研究，實驗結果可長期保存。因此，綜上所述，本文空斑檢測方法成功建立，為后續進一步研究呼腸孤病毒奠定了基礎。

利益沖突：無