首次從喜馬拉雅旱獺分離布魯氏菌與鑒定

謝 輝，薛紅梅，于守鴻，徐立青，馬 麗，楊旭欣，張愛萍

布魯氏菌病由布魯氏菌引起的人獸共患病，嚴重危害人類健康和畜業發展。布魯氏菌廣泛分布于野生動物中[1-3]，如野豬、野牛等可造成布病自然疫源地形成的原因，曾報道新疆地區旱獺布菌血清學調查感染率為0.92%[4]， 1982年在青海海北州海晏縣檢測340份旱獺，血清學檢測陽性率為3.25%，1986年在果洛州達日縣檢測喜馬拉雅旱獺1 117份，血清學檢測1.88%，1994年在海西州天峻縣檢測80份旱獺血清樣品，陽性率2.5%[5-7]，可以推斷喜馬拉雅旱獺可以感染布病，但未能從旱獺體內分離出布魯氏菌。2016年我們檢測喜馬拉雅旱獺245份，陽性率5.31%，并在血樣品中分離出一株疑似布魯氏菌株。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1樣品 為旱獺全血，喜馬拉雅旱獺全血245份采用虎紅平板凝集反應(RPTB)試管凝集反應(SAT),噬菌體試驗及染料抑菌試驗。

1.1.2試劑 改良布魯氏菌肝浸液培養基本所自制，雙相培養基(20160430)布魯氏菌虎紅凝集試驗抗原(2016-1)、凝集試管抗原(2016-2)、因子血清(A.M.R)、噬菌體(Tb、Wb、Bk)由青島眾創生物科技有限公司提供，柯氏染色由索寶萊生物科技有限公司提供，醋酸鉛紙條、硫堇紙片、復紅紙片由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

鑒定用參考菌株：國家標準菌株牛104、羊M5、豬S2均由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所提供。

1.2方 法

1.2.1血清學檢測 使用虎紅平板凝集試驗對旱獺血清進行布魯氏菌陽性抗體的初篩，陽性血清行布氏菌凝集試驗，按照《布氏菌試管(GB/T18646)》判定結果。

1.2.2細菌分離 無菌操作采集旱獺心臟全血，取5 mL加入改良肝浸液雙相培養基及市售雙相血培養基，45°傾斜，使血液均勻分布在瓊脂斜面上，置37 ℃溫箱培養，觀察30 d。

1.2.3主要鑒定方法 1) 柯絲羅夫斯基法及革蘭氏染色法，觀察菌體形態、染色特征； 2)對CO2的需要；3)H2S產生測定；4)染料抑菌試驗；5)A、M、R單因子血清凝集試驗，結果對照布魯氏菌屬分類表。

2 結 果

2.1血清學檢測 共檢測245份旱獺血清，其中13份血清虎紅平板凝集試驗及試管凝集試驗均呈陽性，血清抗體最高滴度為1∶400。

2.2細菌分離 采集旱獺全血先接種于血液增菌液后培養于改良肝浸液培養基和雙相血培養基37 ℃培養，第7 d可見優化肝浸液培養基上生長無色透明、圓形濕潤菌落，直徑為0.6～1 mm，表面凸起，邊緣整齊，在改良肝浸液瓊脂上，培養物呈分散狀，疑似布魯氏桿菌。

2.3鑒 定

2.3.1菌落與菌體形態 菌落為無色透明、圓形、稍隆起、表面光滑、均質樣，菌體為革蘭氏陰性球桿菌，呈單個排列，柯氏染色為紅色，見圖1。

圖1 柯氏染色倒置顯微鏡100倍34號菌株菌體形態Fig.1 Morphology of strain no.34 100 times under an inverted microscope with kirschner staining

2.3.2種型鑒定 經布魯菌常規系列鑒定，并對照布魯氏菌屬的分類表，確定為羊種生物3型布魯氏菌，見表1。

表1 喜馬拉雅旱獺布菌鑒定表Tab.1 Identification of brucella from the Himalayan marmot

3 討 論

根據34號菌落特征、細菌形態、染色特征、生長情況以及某些生化特性, 與羊種布魯氏桿菌標準菌株特性一致，初步鑒定34號菌株為羊種布氏菌。從喜馬拉雅旱獺體內分離出羊種布魯氏桿菌，這在國內外首次發現。本實驗通過對喜馬拉雅旱獺布菌血液初分離時，由于雜菌生長抑制布魯菌，菌落發育不良，需增加刺激目的菌的試劑同時抑制雜菌，再進行分純培養[8]，如直接全血接種培養基，菌株生長緩慢[9-10]，初培養時不需要CO2,最適宜溫度為37 ℃, 34號菌增菌后在改良肝浸液培養基生長良好。喜馬拉雅旱獺布菌在一般培養基上不易生長，在優化的肝浸液培養基上生長良好，檢出率較高，13份抗體陽性血液有1份檢出細菌。

1985年WHO布魯氏菌委員會將布魯氏桿菌分為6個種19個生物型，我國已分離15個生物型，分別為羊種布魯氏菌3個型，牛種布魯氏菌8個型，豬種布魯氏菌2個型，綿羊附睪種布魯氏菌和犬種布魯氏菌個1個型，其中羊布魯氏菌的致病力最強[11-13]傳染面廣,危害嚴重。從喜馬拉雅旱獺體內分離羊種布魯氏菌對于研究該病的致病性、流行特點、探討青藏高原喜馬拉雅旱獺對布病傳播的意義，對了解青藏高原布魯氏桿菌保存機理及疫情變化提供理論依據。

喜馬拉雅旱獺是鼠疫菌的主要宿主，本試驗從喜馬拉雅旱獺血液中分離出布魯氏桿菌，這一發現對于鼠防人員從事血清樣本檢測時，在生物安全防護方面提供新的思路。

利益沖突：無