甲磺酸阿帕替尼通過p53抑制結腸癌細胞HCT116增殖的作用及機制

楊瀚林，湯弘婷，楊娟，劉虹麟，李夢醒，李琴山，4△

結腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，主要表現為腸道侵襲性惡變，是全球范圍內第4 高發的惡性腫瘤，我國每年約有16萬患者死于結腸癌［1-2］。其常用治療手段為手術輔以放療或化療，但目前常用化療藥物容易產生耐藥，且藥物對腫瘤細胞的殺傷作用缺乏靶向性。因此，尋找新的結腸癌化療藥物具有重要臨床意義。甲磺酸阿帕替尼（以下簡稱阿帕替尼）是一類靶向血管內皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factors receptor 2，VEGFR2）的口服小分子受體酪氨酸激酶抑制劑，已在包括消化系統腫瘤在內的多種惡性腫瘤及對其他化療藥物產生耐藥的腫瘤中展現出較好療效［3-5］，有臨床應用前景。但最近研究發現腫瘤細胞可通過多種機制對阿帕替尼產生耐藥性，為阿帕替尼的應用提出了挑戰［6-7］。野生型p53基因是一類重要抑癌基因，在60%的結腸癌中可觀察到p53基因突變，突變型p53促進了結腸癌發生發展［8］。然而研究發現野生型p53基因對腫瘤發生、腫瘤細胞獲得干性、腫瘤對化療藥物產生耐藥有促進作用［9-11］。但野生型p53是否參與了結腸癌細胞對阿帕替尼產生耐藥，目前報道較少。本研究旨在通過體外實驗觀察敲除結腸癌細胞HCT116 的野生型p53后，阿帕替尼對HCT116殺傷作用的變化，從而為阿帕替尼治療結腸癌提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人結腸癌HCT116 p53+/+細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；以CRISPR-Cas9法構建的敲除野生型p53的人結腸癌HCT116 p53-/-細胞株由中日友好醫院劉虹麟副教授饋贈。

1.1.2 藥品、試劑及儀器 DMEM 培養基、青霉素/鏈霉素混合液購自美國sigma 公司。胎牛血清、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司。RIPA 蛋白裂解液、5 倍濃縮的蛋白上樣緩沖液購自北京普利萊基因技術有限公司。PMSF購自北京索萊寶科技有限公司。甲磺酸阿帕替尼片購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。CCK-8 細胞增殖毒性檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所。BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光液、Annexin V/PI 流式細胞凋亡試劑盒、RNA 逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司。鼠抗人 P53 抗體、兔抗人 NF-κB p65 抗體、兔抗人Caspase-3 抗體購自美國CST 公司。鼠抗人GAPDH 抗體購自美國Proteintech 公司。山羊抗兔IgG 二抗抗體、兔抗鼠IgG 二抗抗體均購自美國sigma 公司。0.22 μm PVDF 膜購自美國Merck Millipore 公司。RNA 提取試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒均購自德國Qiagen 公司。Quantinovo Q5 實時熒光定量PCR 儀購自美國Thermo Fisher公司。FACSCantoⅡ流式細胞儀購自美國BD公司。Western blot電泳儀、ChemiDoc成像儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素混合液的DMEM完全培養基，在37 ℃、5%CO2培養箱中進行培養。待細胞長滿培養瓶底面積80%～90%時進行傳代。細胞傳代時，棄去舊培養基，以D-Hanks 洗細胞3 次，0.1%胰蛋白酶消化。隨后加入含胎牛血清的培養基終止消化，離心收集細胞。以新鮮的DMEM完全培養基重懸細胞，將細胞傳至2個新的培養瓶中，加入適量DMEM 完全培養基繼續培養細胞。選取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 取對數生長期的HCT116p53+/+、HCT116 p53-/-細胞，按常規胰酶消化方法制備細胞懸液，隨后按照5×103細胞/孔將細胞接種于96孔板，接種24 h后加入藥物處理。實驗共設計4組，阿帕替尼濃度分別為0、15、30、60 μmol/L，并設置僅有等體積DMEM 完全培養基的空白孔排除培養基干擾。實驗共設置2個檢測時間點：24 h和48 h，每組設置3個復孔。藥物處理24、48 h后，每孔加入10 μL的CCK-8 試劑，繼續培育2 h。以酶標儀檢測450 nm 波長下各孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率。

1.2.3 Annexin V-APC/PI 法檢測細胞凋亡 取對數生長期的HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞，按照2×105細胞/孔將細胞接種于6 孔板，接種24 h 后加入藥物處理。實驗共設計3組，阿帕替尼濃度分別為0、15、30 μmol/L。藥物處理24 h后收集細胞，以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照試劑盒說明書進行Annexin V-APC、PI染色，隨后上機檢測細胞凋亡情況。

1.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測p53、NF-κB p65、Caspase-3mRNA 表達 以 0、15、30 μmol/L 阿帕替尼處理 HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞24 h，隨后按照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA。以微量分光光度計測RNA 濃度，按照試劑盒說明書將RNA 逆轉錄為cDNA，反應條件為：65 ℃5 min；25 ℃ 5 min；42 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min。以微量分光光度計測cDNA 濃度后按照實時熒光定量PCR 試劑盒說明書檢測細胞中p53、NF-κB p65、Caspase-3的mRNA表達水平。實時熒光定量 PCR 反應條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 13 s，進行40 個循環。引物由美國Invitrogen 公司合成，引物序列見表1。以2-ΔΔCt法計算各組細胞目的基因相對表達水平。

1.2.5 Western blot 檢測 P53、NF-κB p65、Caspase-3 蛋白表達 以 0、15、30 μmol/L 阿帕替尼處理 HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞24 h后提取細胞總蛋白，以BCA法檢測各樣本蛋白濃度，100 ℃加熱10 min蛋白變性后，立即進行蛋白電泳、轉膜。轉膜結束后，PVDF 膜以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，隨后加入 P53（1∶1 000 稀釋）、NF-κB p65（1∶1 000 稀釋）、Caspase-3（1∶1 000 稀釋）、GAPDH（1∶10 000 稀釋）一抗，4 ℃搖床孵育過夜。TBST 洗4 次，隨后加入HRP 標記的二抗（1∶20 000稀釋），室溫搖床孵育2 h，TBST洗4次。根據ECL 化學發光檢測試劑盒說明書配置發光液，以Bio-Rad 成像儀進行條帶顯色，以Image J 軟件進行半定量分析，以目的蛋白/內參蛋白（GAPDH）的灰度值作為蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法 選用SPSS 23.0統計學分析軟件進行統計學分析，計數資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，2組間比較用成組t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCT116 p53-/-細胞的敲除效果 Western blot結果顯示，HCT116 p53-/-細胞內未檢測到P53 蛋白的表達，提示p53基因敲除成功，HCT116 p53-/-細胞可用于后續實驗，見圖1。

Fig.1 Knockout effect of p53 in HCT116 p53-/-cell圖1 HCT116 p53-/-細胞的p53敲除效果

2.2 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞增殖的影響 CCK-8 結果顯示，阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞均有增殖抑制作用（P＜0.01），且隨藥物濃度增加，阿帕替尼對2 種細胞的增殖抑制作用均逐漸增強（P＜0.05）。與藥物處理24 h 后相比，阿帕替尼作用48 h 后對2 種細胞的增殖抑制作用增強（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Effects of different concentrations of apatinib on HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cell viability表2 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞存活率的影響 （n=3，%，）

Tab.2 Effects of different concentrations of apatinib on HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cell viability表2 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞存活率的影響 （n=3，%，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與 0 μmol/L 組比較，b 與 15 μmol/L 組比較，c與30 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組60 μmol/L組F HCT116 p53+/+24 h 100.00±9.93 83.06±1.96a 69.73±2.65ab 41.88±3.60abc 59.048＊＊48 h 100.00±8.29 71.34±2.37a 58.87±4.05ab 29.96±1.84abc 107.607＊＊t-4.944＊6.040＊5.549＊組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組60 μmol/L組F HCT116 p53-/-24 h 100.00±6.20 85.92±2.11a 74.84±4.52ab 55.77±5.27abc 45.915＊＊48 h 100.00±2.87 74.39±1.99a 64.94±4.37ab 42.98±2.70abc 173.013＊＊t-12.801＊6.654＊5.666＊

2.3 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，梯度濃度阿帕替尼處理HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞24 h后，與 0 μmol/L 組相比，15、30 μmol/L 組的細胞凋亡率增高（P＜0.05），且與HCT116 p53+/+細胞相比，相同濃度阿帕替尼處理下，HCT116 p53-/-細胞的凋亡率較低（P＜0.05），見表3、圖2。

Tab.3 Effects of different concentrations of apatinib on apoptosis rates in HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cells表3 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞凋亡率的影響 （n=3，%，）

Tab.3 Effects of different concentrations of apatinib on apoptosis rates in HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cells表3 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞凋亡率的影響 （n=3，%，）

＊＊P＜0.01；a與0 μmol/L組比較，b與15 μmol/L組比較，P＜0.05

組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F HCT116 p53+/+29.76±1.57 38.27±1.43a 42.73±3.52a 23.123＊＊HCT116 p53-/-7.23±2.04 16.91±2.60a 22.86±7.18ab 28.011＊＊t -12.071＊＊5.270＊-

2.4 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3mRNA 表達水平的影響 實時熒光定量PCR 結果顯示，與0 μmol/L 組相比，梯度濃度阿帕替尼處理24 h 后，HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3mRNA 表達水平均升高（P＜0.05），且在 HCT116 p53+/+細胞中的表達水平高于HCT116 p53-/-細胞（P＜0.05），見表4。

Fig.2 Effects of different concentrations of apatinib on apoptosis rates of HCT116 p53+/+and HCT116 p53-/-cells圖2 不同濃度阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-凋亡率的影響

2.5 阿帕替尼對HCT116 p53+/+、HCT116 p53-/-細胞的 P53、NF-κB p65、Caspase-3 蛋白表達水平的影響 Western blot 結果顯示，梯度濃度阿帕替尼處理24 h 后，與 0 μmol/L 組相比，HCT116 p53+/+中 P53、NF-κB p65 蛋白表達水平降低，但 HCT116 p53-/-的NF-κB p65蛋白表達水平升高（P＜0.05），見表4、圖3。阿帕替尼處理后2種細胞的Caspase-3蛋白表達水平均升高，且HCT116 p53+/+的表達水平高于HCT116 p53-/-的表達水平（P＜0.01），見表4、圖3。

Tab.4 The relative expression levels of p53,NF-κB p65 and Caspase-3 mRNA and protein of three groups表4 各組細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平 （n=3，）

Tab.4 The relative expression levels of p53,NF-κB p65 and Caspase-3 mRNA and protein of three groups表4 各組細胞的p53、NF-κB p65、Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平 （n=3，）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01；a與0 μmol/L組比較，b與15 μmol/L組比較，P＜0.05

p53 mRNA HCT116 p53-/-組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F HCT116 p53+/+1.00±0.09 1.18±0.05a 1.61±0.06ab 64.772＊＊HCT116 p53-/-0.05±0.00 0.14±0.01a 0.26±0.02ab 202.427＊＊t -30.575＊＊36.473＊＊-P53蛋白HCT116 p53+/+2.16±0.20 0.45±0.05a 0.19±0.03ab 230.220＊＊----組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F NF-κB p65 mRNA HCT116 p53+/+1.00±0.22 1.26±0.03a 1.66±0.14ab 43.791＊＊HCT116 p53-/-0.29±0.02 0.64±0.03a 0.78±0.38ab 212.895＊＊t -16.704＊＊12.007＊＊-NF-κB p65蛋白HCT116 p53+/+2.71±0.09 2.45±0.11a 1.96±0.11ab 41.224＊＊HCT116 p53-/-0.91±0.12 1.73±0.14a 1.84±0.15ab 26.955＊＊組別0 μmol/L組15 μmol/L組30 μmol/L組F Caspase-3 mRNA Caspase-3蛋白t -t -13.038＊＊24.548＊＊-HCT116 p53+/+1.01±0.14 1.29±0.17a 1.71±0.02ab 22.162＊HCT116 p53-/-0.53±0.03 0.68±0.47a 0.76±0.09a 10.099＊5.262＊17.467＊＊-HCT116 p53+/+0.46±0.06 1.83±0.17a 2.86±0.17ab 214.365＊＊HCT116 p53-/-0.10±0.01 0.39±0.03a 0.32±0.01ab 145.148＊＊

Fig.3 Western blot results of p53,NF-κB p65 and Caspase-3 protein expressions圖3 Western blot檢測p53、NF-κB p65、Caspase-3蛋白表達水平

3 討論

結腸癌因發病較隱蔽、早期癥狀不明顯，多數患者就診時已錯過了最佳治療時機導致治療效果不理想，如何有效治療結腸癌一直是難題。目前結腸癌常用化療藥物主要包括5-氟尿嘧啶、卡培他濱、奧沙利鉑等。常規化療藥物因不良反應明顯，缺乏靶向性，還會殺傷正常細胞，故使用受到很多限制。近年來，靶向治療藥物因其特異性與腫瘤細胞位點結合，對正常細胞殺傷小，成為腫瘤治療的新方向。阿帕替尼是一類靶向VEGFR2的小分子受體酪氨酸激酶抑制劑，已證實了其在胃癌、肺癌、胰腺癌中的抗癌作用［12-14］，但目前關于阿帕替尼在結腸癌中作用的研究較少，其對結腸癌細胞作用的具體機制尚不明確。除已經報道的作用靶點外，阿帕替尼是否通過其他靶點對結腸癌細胞產生殺傷作用還需進一步研究探討。

本研究發現，與HCT116 p53+/+細胞相比，阿帕替尼處理后HCT116 p53-/-的凋亡率更低。這與Boyer等［11］研究結果一致，他們發現，5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等對敲除野生型p53后結腸癌細胞HCT116 的抑制作用降低，敲除野生型p53后結腸癌細胞對藥物產生耐藥。因此，本研究提示野生型p53參與結腸癌細胞對阿帕替尼產生耐藥的過程。

p53是一類重要抑癌基因，野生型p53可促進受損DNA 修復，抑制腫瘤發展，但近年來研究顯示野生型p53可以參與腫瘤發生。Kim等［9］發現，野生型p53在肝癌中通過促進PUMA基因表達，發揮促癌作用；在肝癌細胞中，野生型p53可促進腫瘤細胞發生代謝轉換，促進腫瘤發展。本研究發現，阿帕替尼處理HCT116p53+/+細胞后，降低了P53 蛋白表達，與Jiang等［15］的研究結論一致。因此，筆者推斷野生型p53可能在結腸癌細胞HCT116中發揮促癌作用，阿帕替尼通過降低野生型p53的表達而發揮腫瘤殺傷作用。

NF-κB 通路在多種惡性腫瘤中組成性高表達，促進腫瘤細胞增殖、阻止腫瘤細胞凋亡、增加腫瘤的血管生成和轉移潛力，與腫瘤的發生發展密切相關［16］。NF-κB 通路經典激活途徑為：在腫瘤壞死因子等相關信號分子刺激下，細胞質中NF-κB p65/p50 復合物與 IκB 解離，NF-κB p65/p50 復合物轉移至細胞核中，與下游目的基因結合而發揮調控作用［17］。腫瘤壞死因子促進NF-κB通路激活需p53參與［18］，NF-κB 通路激活后，可抑制腫瘤細胞發生凋亡，促進腫瘤發生［19］。NF-κB 通路可促進結腸癌細胞增殖、轉移，促進腫瘤血管生長，對結腸癌的發生發展起到正向調控作用［20］。Caspase-3 處于細胞凋亡機制網絡的核心位置，是細胞凋亡的執行分子，Caspase-3激活后作用于下游分子，誘導細胞發生凋亡［21］。Capsase-3也可通過促進NF-κB p65降解，抑制NF-κB通路激活［22］。本研究發現，阿帕替尼可下調結腸癌細胞HCT116中p53+/+的P53、NF-κB p65蛋白表達，抑制NF-κB通路激活，并促進Caspase-3蛋白表達，促進細胞凋亡，提示阿帕替尼可能通過抑制p53/NF-κB 通路而促進結腸癌細胞的凋亡；但敲除結腸癌細胞P53 表達后，阿帕替尼反而促進了NF-κB p65 蛋白表達。同時，阿帕替尼處理后，與HCT116 p53+/+細胞相比，HCT116 p53-/-細胞的Caspase-3 蛋白表達降低，提示敲除p53 后降低了阿帕替尼對結腸癌細胞的殺傷作用。本研究還發現，阿帕替尼處理后，結腸癌細胞的p53、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達情況不一致，筆者推測可能與mRNA轉錄為蛋白的過程中還存在眾多調控機制的影響有關，如基因轉錄、翻譯過程存在一定延遲［23］，以及不同mRNA 的轉錄速率可能存在差異［23］等，mRNA 與蛋白表達水平在某些程度上不一定相符。因此提示，阿帕替尼可能影響p53、NF-κB p65等基因從mRNA 翻譯至蛋白的過程，但具體調控機制需要進一步研究探討。

綜上，阿帕替尼可能通過p53/NF-κB 通路促進結腸癌細胞發生凋亡，敲除野生型P53 后，與HCT116 p53+/+細胞相比，阿帕替尼處理后HCT116 p53-/-細胞的凋亡率較低，提示野生型P53 參與了結腸癌對阿帕替尼產生耐藥的過程，本研究為阿帕替尼治療結腸癌的臨床使用提供一定理論基礎。