基于OPG/RANKL信號通路探討姜黃素對去勢骨質疏松模型大鼠骨代謝平衡的影響

張慶剛 張慶紅 張克民 姚明 田月洋 毛小莉 馮宜蒀 王卉

摘 要 目的：探討姜黃素對去勢骨質疏松模型大鼠骨代謝平衡的影響，并探討其可能機制。方法：將雌性Wistar大鼠隨機分為空白組（A組）、模型組（B組）、雌二醇組[C組（陽性對照），戊酸雌二醇50 μg/（kg·d）]和姜黃素低、中、高劑量組[D～F組，55、110、165 μg/（kg·d）]，每組15只。除A組外，其余各組均采用去卵巢法建立去勢骨質疏松模型。造模后，A、B組大鼠均灌胃生理鹽水，各給藥組灌胃相應藥物，體積均為30 mL/kg，每日1次，連續12周。采用酶聯免疫吸附測定法檢測各組大鼠血清骨代謝標志物[骨特異性堿性磷酸酶、核心結合因子α1、Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽、Ⅰ型前膠原氨基端前肽、骨鈣素]含量，采用實驗動物微型CT影像系統檢測大鼠骨密度（BMD）和骨小梁結構參數[相對骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、連接密度（Conn.D）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、結構模型指數（SMI）]，采用逆轉錄聚合酶鏈式反應法和Western blotting法分別檢測下丘腦和股骨組織中骨保護素（OPG）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）mRNA及蛋白的表達情況。結果：與A組比較，B組大鼠血清骨代謝標志物含量，BMD和BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D以及OPG mRNA及其蛋白的表達量均顯著降低，Tb.Sp、SMI以及RANKL mRNA及其蛋白的表達量均顯著升高（P<0.05）。與B組比較，各給藥組大鼠血清骨代謝標志物含量，BMD和BV/TV、? ? ?Tb.N、Tb.Th、Conn.D以及OPG mRNA及其蛋白的表達量均顯著升高，Tb.Sp、SMI以及RANKL mRNA及其蛋白的表達量均顯著降低，且姜黃素各組效果均呈劑量依賴性（P<0.05或P<0.01）。結論：姜黃素能夠改善去勢骨質疏松模型大鼠的骨代謝水平，增加其BMD、改善骨小梁微結構、抑制骨吸收;這種作用可能與調控OPG/RANKL信號通路有關。

關鍵詞 骨質疏松;姜黃素;骨代謝平衡;骨保護素/核因子κB受體活化因子配體信號通路;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of curcumin on bone metabolism balance in ovariectomized osteoporosis model rats， and to investigate its potential mechanism. METHODS： Totally female Wistar rats were randomly divided into blank group （group A）， model group （group B）， estradiol group [group C （positive control）， estradiol valerate 50 μg/（kg·d）]， curcumin low-dose， medium-dose and high-dose groups [group D-F， 55， 110， 165 μg/（kg·d）]， with 15 rats in each group. Except for group A， other rats were ovariectomized to establish osteoporosis model. After modeling， group A and B were given normal saline intrgastrically， and administration groups were given relevant medicine intrgastrically 30 mL/kg， once a day， for consecutive 12 weeks. The contents of serum bone metabolism markers [BALP， CBF-α1， CTX-Ⅰ， PINP and OC] were determined by ELISA. The bone mineral density （BMD） and trabecular structure indexes [relative bone volume fraction （BV/TV）， trabecular number? （Tb.N）， trabecular thickness （Tb.Th）， connectivity density （Conn. D）， trabecular separation （Tb.Sp） and structure model index （SMI）] were determined by micro CT imaging system. The mRNA and protein expression of OPG and RANKL in hypothalamus and femur were determined by RT-PCR and Western blotting assay. RESULTS： Compared with group A， the contents of serum bone metabolism markers， BMD， BV/TV， Tb.N， Tb.Th， Conn.D， mRNA and protein expression of OPG were decreased significantly in group B， while Tb.Sp， SMI， mRNA and protein expression of RANKL were increased significantly （P<0.05）. Compared with group B， the contents of serum bone metabolism markers， BMD， BV/TV， Tb.N， Tb.Th， Conn.D， mRNA and protein expression of OPG were increased significantly in administration groups; Tb.Sp， SMI， mRNA and protein expression of RANKL were decreased significantly， in a dose-dependent manner among curcumin groups （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Curcumin can improve the level of bone metabolism， increase BMD， improve the trabecular microstructure and inhibit bone absorption in ovariectomized osteoporosis model rats. Its mechanism may be related to the regulation of OPG/RANKL signaling pathway.

KEYWORDS? ?Osteoporosis; Curcumin; Bone metabolism balance; OPG/RANKL signaling pathway; Rats

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是臨床常見疾病，該病的發生多與骨質退變、骨量減少以及骨微結構改變有關，可降低骨載荷承受力、增加骨脆性，從而引起患者慢性疼痛并且增加骨折風險[1]。因此，臨床評價多從患者骨量、骨代謝標志物等指標入手。有研究發現，OP的發生是免疫系統、神經系統、內分泌系統等多系統共同作用的結果[2]。近年來有學者指出，骨保護素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）信號通路對破骨細胞形成、分化和吸收具有重要的調節作用[3]。姜黃素可從姜科、天南星科等植物的根莖中分離得到的一種天然活性成分，具有改善骨微結構、促進成骨細胞生成的作用[4-5]。基于此，本研究通過切除雌性大鼠雙側卵巢的方法建立去勢OP動物模型，并給予姜黃素進行干預，觀察該化合物對大鼠OPG/RANKL信號通路以及骨代謝平衡的影響，旨在為姜黃素臨床治療OP提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Benchmark Plus型酶標儀（美國Bio-Rad公司）;Inveon型實驗動物微型計算機斷層掃描（CT）影像系統（德國Siemens公司）;DXA型骨密度（BMD）儀（徐州品源醫療科技有限公司）;Tannon-5200型成像系統（上海天能科技有限公司）;ABI 7300型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）;TG-16M型離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

姜黃素對照品（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20160703，純度：99.8%）;戊酸雌二醇片（陽性對照，德國Bayer公司，批號：JYHB1901034，規格：1 mg）;山羊抗兔OPG抗體（批號：bs-0431R-1）、大鼠源RANKL抗體（批號：bs-0747R-1）、大鼠源GAPDH抗體（批號：bs- 00542R-1）均購自博奧森（北京）生物技術有限公司;小鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國Abcam公司，批號：Ab179696）;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（上海長島生物技術有限公司，批號：D-3004）;ECL顯色試劑盒（批號：R1600）、RIPA組織/細胞快速裂解液（批號：BYL40836）均購自基爾頓生物科技（上海）有限公司;骨特異性堿性磷酸酶（BALP）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（批號：E201902）、核心結合因子α1（CBF-α1）ELISA檢測試劑盒（批號：E201906）、Ⅰ型膠原交聯羧基末端肽（CTX-Ⅰ）ELISA檢測試劑盒（批號：E201906）、Ⅰ型前膠原氨基端前肽（PINP）ELISA檢測試劑盒（批號：E201905）、骨鈣素（OC）ELISA檢測試劑盒（批號：E201901）均購自北京方程生物科技有限公司;PCR擴增引物由上海英駿生物技術有限公司設計、合成（引物序列見表1）;RNA抽提試劑盒（批號：DP419）、BCA蛋白測定試劑盒（批號：PICPI23222）、SYBR Green PCR試劑盒（含SYBR Pri mix等試劑，批號：K0223）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;逆轉錄試劑盒（美國Fermentas公司，批號：K1622）;上樣緩沖液（中國醫藥集團有限公司，批號：K0223）;0.9%氯化鈉溶液（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20190001;作生理鹽水用）;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為去離子水。

1.3 動物

SPF級Wistar大鼠90只，雌性，23周齡，體質量（180±20） g，由華中科技大學實驗動物中心提供，動物生產合格證號：SCXK（鄂）2016-0009。所有大鼠均適應性喂養1周后開始實驗。本研究試驗過程及操作均遵守國家健康與醫學研究委員會（NHNRC）的動物道德準則，并經華中科技大學動物實驗倫理委員會審核批準。

2 方法

2.1 分組與造模

將Wistar大鼠隨機分為空白組（A組）、模型組（B組）、雌二醇組（C組）和姜黃素低、中、高劑量組（D～F組），每組15只。除A組不作任何處理外，其余各組大鼠均參照文獻去卵巢法[6-7]建立OP模型：腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進行麻醉后，以俯臥位固定，于大鼠背部脊柱兩側切口，在無菌條件下摘除其雙側卵巢，以BMD明顯降低、骨小梁微結構受損嚴重判定模型復制成功[8]。

2.2 給藥

手術3個月后，A、B組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，C組大鼠灌胃戊酸雌二醇[50 μg/（kg·d），以水為溶劑;劑量設置參考成人等效劑量并按人鼠體型系數換算而得]，D～F組大鼠均灌胃相應姜黃素混懸液[55、110、165 μg/（kg·d），以水為溶劑;劑量設置參考本課題組前期預實驗結果]。灌胃體積均為30 mL/kg，每日1次，連續12周。

2.3 標本采集與指標檢測

2.3.1 血清骨代謝標志物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC含量檢測 末次給藥后，處死大鼠，于心臟取血2 mL，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清中BALP、CBF-? ? α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC的含量，嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.3.2 BMD及骨小梁微結構參數檢測 分離各組大鼠右側股骨標本，使用實驗動物微型CT影像系統對遠端干骺端進行掃描（掃描電壓：65 kV，電流：384 mA，分辨率：18 μm）。掃描完成后，選擇感興趣區域（ROI）行三維重組后提取圖像資料，利用專用骨骼分析軟件Advanced Bone Analysis（ABA）2.0進行骨組織計量學分析，包括BMD、相對骨體積分數（BV/TV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、連接密度（Conn.D）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、結構模型指數（SMI）。上述所有操作均由同一組研究人員完成。

2.3.3 下丘腦和股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達情況檢測 采用逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RT-PCR）檢測。各組大鼠采血后，取其下丘腦和股骨組織適量，用RNA抽提試劑盒提取組織中總RNA，對RNA純度、含量進行檢測后使用逆轉錄試劑盒獲取cDNA。以上述cDNA為模板，進行擴增。反應體系（共20 μL）：SYBR Pri mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL;反應條件：95 ℃預變性20 s;95 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共45個循環。以GAPDH為內參，使用熒光定量PCR儀檢測，并以2-ΔΔCt法計算各目標mRNA的表達量（Ct表示每個反應管內熒光信號強度達到設定閾值時所經歷的循環數）。

2.3.4 下丘腦和股骨組織中OPG、RANK蛋白表達情況檢測 采用Western blotting法檢測。取“2.3.3”項下各組大鼠下丘腦和股骨組織適量，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min，采用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經變性后，取適量用上樣緩沖液稀釋，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至聚偏二氟乙烯膜上，于4 ℃下加入相應一抗（稀釋度均為1 ∶ 500），4 ℃孵育過夜;以三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液洗滌5 min×3次，加入相應二抗（稀釋度均為1 ∶ 500），室溫孵育2 h;以TBST溶液洗滌5 min×3次，以ECL試劑顯色后，于成像系統上成像并使用QuantityOne v4.52軟件進行分析。以目標蛋白與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示該目標蛋白的表達量。

2.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用F檢驗，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠血清骨代謝標志物含量比較

與A組比較，B組大鼠血清BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC含量均顯著降低（P<0.05）。與B組比較，C～F組大鼠血清上述指標均顯著升高（P<0.05）;且E組、F組顯著高于D組，F組顯著高于E組（P<0.05），詳見表2。

3.2 各組大鼠BMD及骨小梁微結構參數比較

與A組比較，B組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均顯著降低，Tb.Sp、SMI均顯著升高（P<0.05）。與B組比較，C～F組大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均顯著升高，且E組、F組上述指標均顯著高于D組，F組顯著高于E組;Tb.Sp、SMI均顯著降低，且E組、F組上述指標均顯著低于D組，F組顯著低于E組（P<0.05），詳見表3。

3.3 各組大鼠下丘腦和股骨組織中OPG、RANKL mRNA表達量比較

與A組比較，B組大鼠下丘腦和股骨組織中OPG mRNA的表達量顯著降低，RANKL mRNA的表達量顯著升高（P<0.05）。與B組比較，C～F組大鼠下丘腦及股骨組織中OPG mRNA的表達量均顯著上升，且E組、F組上述指標顯著高于D組，F組顯著高于E組;RANKL mRNA的表達量均顯著降低，且E組、F組上述指標均顯著低于D組，F組顯著低于E組（P<0.05），詳見表4。

3.4 各組大鼠下丘腦和股骨組織中OPG、RANKL蛋白表達量比較

與A組比較，B組大鼠下丘腦和股骨組織中OPG蛋白的表達量顯著降低，RANKL蛋白的表達量顯著上升（P<0.05）。與B組比較，C～F組大鼠下丘腦及股骨組織中OPG蛋白的表達量均顯著升高，且E組、F組顯著高于D組，F組顯著高于E組;RANKL蛋白的表達量均顯著降低，且E組、F組顯著低于D組，F組顯著低于E組（P<0.05），詳見圖1、表5。

4 討論

OP發病原因復雜多變，目前多認為其與微循環障礙、代謝異常、基因多態性等多種因素有關[9-10]。隨著人口老齡化加劇，全球OP患者的數量正在逐年增加，由其導致的骨折風險也越來越高[11]。中醫學將OP歸屬于“骨痿”“骨枯”等范疇，辨證論治時多從腎肝脾等臟腑入手。西醫治療OP的主要藥物包括雌激素調節藥物、骨形成促進藥物、骨礦化促進藥物等，但長期使用會引發一系列毒副反應，如骨脆性增加、骨折易發等全身骨骼疾病[12]。姜黃素是從姜科、天南星科等植物的根莖中提取的一種多酚類化學成分，具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等多種藥理作用[13]。近期有研究表明，姜黃素對于修復細胞、調節骨再造、改善骨質量等的效果明顯[14]。基于此，本研究以戊酸雌二醇為陽性對照，初步考察了姜黃素對去勢OP模型大鼠骨代謝平衡的影響及可能機制。

CBF-α1由成骨細胞特異性表達，是決定成骨細胞分化的重要因子，在維持骨骼正常生長發育中起著重要作用。已有研究證實，CBF-α1不僅能夠調節成骨細胞分化，還能調控已分化成骨細胞的發育和生長因子的表達，從而控制骨骼形成和發育的生理過程[15]。CTX-Ⅰ是骨吸收過程中Ⅰ型膠原釋放入血的產物;PINP為Ⅰ型前膠原細胞胞外分泌產物，是骨形成的敏感指標;血液中上述兩種指標的含量可反映Ⅰ型膠原合成速率、成骨細胞活動以及骨吸收情況，是診斷OP的特異性指標[16-17]。OC是成骨細胞分泌的一種非膠原蛋白，其含量變化是成骨細胞活動以及骨代謝變化的重要標志[18]。由此可見，CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP以及OC含量均能特異性地反映OP骨代謝平衡情況。

OPG/RANKL信號通路是成骨細胞與破骨細胞相互作用機制中較重要的通路之一，其可有效調控破骨細胞生成并控制骨代謝，與OP發病機制密切相關[19]。下丘腦能通過分泌多種因子調控破骨細胞來釋放骨吸收標志物，BALP就是其中之一。有研究發現，BALP可誘導成骨細胞分泌RANKL，調控骨吸收[20]。OPG是由成骨細胞分泌的RANKL誘餌受體，在BALP干預下可與RANK競爭性結合RANKL，從而誘導破骨細胞凋亡、抑制骨吸收。有研究證實，補充外源性OPG可提高OP患者BMD、增強骨強度、促進骨吸收[21]。此外，BMD及骨小梁微結構改變可有助于預測OP的發生與發展，可為該病的診斷提供重要參考[22]。基于此，本研究以BMD，骨小梁微結構參數，血清BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC含量以及小丘腦/股骨組織中OPG、RANKL蛋白及其mRNA的表達量為考察指標，初步評價了姜黃素對去勢OP模型大鼠骨代謝平衡的影響。

本研究結果顯示，在摘除卵巢后，大鼠血清中骨代謝標志物BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC含量以及BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D均顯著降低，Tb.Sp和SMI均顯著升高，提示大鼠骨量丟失、骨吸收增加、骨小梁顯微結構受損，與OP病理表現相符，表明模型復制成功。此外，OP模型大鼠下丘腦和股骨遠端組織中OPG/RANKL蛋白及其mRNA的表達量也發生了明顯的變化，其中OPG表達下調、RANKL表達上調，提示OP模型大鼠的骨量丟失、骨吸收增加可能與下丘腦和股骨組織中OPG/RANKL通路有關。經姜黃素處理后，各給藥組大鼠血清骨代謝標志物含量，BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D以及OPG蛋白及其mRNA的表達量均顯著升高，Tb.Sp、SMI以及RANKL蛋白及其mRNA的表達量均顯著降低，且呈劑量依賴性，提示姜黃素能劑量依賴性地改善大鼠的骨代謝平衡，增加其BMD、抑制骨吸收、改善骨小梁微結構，這與許東亮等[23]、蔣琪等[24]研究結果一致;同時，上述作用可能與姜黃素調控OPG/RANKL信號通路的表達有關。

綜上所述，姜黃素能夠改善去勢OP模型大鼠骨代謝水平，可增加BMD、抑制骨吸收、改善骨小梁微結構，其機制可能與調控OPG/RANKL信號通路有關。本課題組后續將進一步增加藥物干預劑量、擴大實驗動物樣本量、延長藥物干預時間，以進一步挖掘姜黃素對去勢OP模型大鼠骨代謝平衡改善作用的量效關系。

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（收稿日期：2020-03-15 修回日期：2020-07-20）

（編輯：張元媛）