硬組織切磨技術及操作要點

毛永建，李華

北京市醫(yī)療器械檢驗所 （北京 101111）

近年來，隨著科學技術水平的提高，醫(yī)療器械產業(yè) 迅速發(fā)展，醫(yī)療器械生物安全性評價試驗越來越完善。植入性局部反應試驗是醫(yī)療器械生物安全性評價的重要試驗項目，其中很多齒科材料、骨科材料、血管支架等器械材料的組分是鈦、鎳、鎂等金屬材料或高強度的高分子聚合物，使得普通石蠟切片技術已經無法滿足組織制片的需求，而硬組織切磨技術的出現彌補了這一短板[1]。本研究以EXAKT 硬組織切磨設備為例，闡述制備硬組織磨片的技術方法及操作要點（目前，市場上制備硬組織磨片的設備有多種，其中大多數制作方法與EXAKT 切磨方法大同小異，制作步驟亦可參考此方法）。

1 設備與材料

1.1 設備

EXAKT 切磨系統(tǒng)。

1.2 試劑

10%中性甲醛、梯度乙醇、Technovit 7200VLC 光固化樹脂、Technovit 7210VLC 精密粘合樹脂、Technovit 4000冷固化樹脂。

2 方法

2.1 固定與分切

在標本取材后，應立即將其放入10%中性甲醛固定液中（pH 為7.0）初固定1～2 d，固定液與組織的比例至少為10:1。

在較大組織標本初固定后，精確定位所需觀察的組織或植入物，用E300CP 組織切片機分切成小且薄的組織塊，繼續(xù)固定（以5 mm 厚度為例，繼續(xù)固定1～2 d）；如果是較大的動物組織標本或植入物，無法分切得很薄，則固定時間應成倍增加，但若固定時間過長，甲醛會呈弱酸性，影響后期的染色。

2.2 脫水

乙醇濃度梯度為70%、80%、90%、95%、100%、100%。為防止組織塊收縮過快，要從低濃度的乙醇開始脫水，并根據組織塊的種類、大小薄厚等確定脫水時間。表1是一塊含金屬材料骨組織的參考脫水時間。

表1 體積為1 cm3含金屬材料骨組織的脫水時間

同等體積的肌肉和皮膚植入組織的脫水時間略短于骨植入組織，其中低濃度的乙醇脫水時間相對較長，高濃度的相對較短。當組織塊過大過厚時，應間斷進行負壓抽真空處理，根據實際情況觀察組織脫水的狀態(tài)，靈活調控時間。

2.3 浸透

將脫水后的標本逐級浸入無水乙醇/7200VLC 光固化樹脂中，具體時間根據樣品調整。表2是體積為1 cm3含植入物肌肉組織的浸透時間。

表2 體積為1 cm3含植入物肌肉組織的浸透時間

同等體積的骨或皮膚植入組織的浸透時間可參考肌肉植入組織。為了使7200VLC 光固化樹脂更好地浸透到組織中，間斷進行抽真空處理非常必要。因浸透前期組織塊中含有無水乙醇，所以長時間抽真空很可能使組織龜裂。如無抽真空設備，表2中抽真空的步驟會導致浸透時間延長1～2 d。一旦浸透不好，切磨片時組織塊表面會有很多空腔或造成樣品、組織脫落，因此，不建議浸透時間太短。

2.4 包埋

使用光固化包埋機低強度光源（黃光），使包埋介質進一步聚合，時間需要4～6 h，環(huán)境溫度應低于40 ℃[2]，如此得到的樹脂膠硬度較高且固化較穩(wěn)定。

使用藍色光源，使浸透到組織內的包埋介質完全固化，時間為8～12 h。

包埋時要選擇合適的包埋模具，為節(jié)省空間及時間，如果組織標本塊較小，則可以在一個包埋模具中同時包埋數塊組織，但一定要標記好每一塊組織的擺放位置且確保位置適當，方便后期分切。

2.5 組織標本塊基座的制作

將玻璃載片吸附在真空粘合壓片器上，然后使用Technovit 4000冷固化樹脂將組織標本塊固定在玻片上，注意Technovit 4000冷固化樹脂Ⅰ液:Ⅱ液:粉末的最佳比例應為2:1:3，如果比例恰當，Technovit 4000會很快固化，若攪動不充分固化，會導致磨片時遇水粘合不牢，可以先將兩種液體混合均勻，然后加入定量的白色粉末中，用攪拌棒快速充分攪動。需要注意的是，因Technovit 4000有毒有害，所以操作最好在通風良好的環(huán)境中進行，并佩戴護具。

對組織標本塊進行初步研磨，露出所需觀察的組織面，如果觀察到組織面有空腔或裂紋，則使用E530型干燥聚合修復裝置，在組織表面滴上7200VLC 樹脂（量不宜太多，鋪滿組織面即可），然后進行負壓抽真空，再修復固化1次；修復后，待組織塊完全干燥再進行研磨等操作，否則會有7200VLC 殘留成分或殘留樣品，待染色后，于鏡下觀察有油污狀污染物，會影響閱片[3]。

在E400CS 組織磨片機上用砂紙（320、500、800、1 200、2 500、4 000目等）將附有下載片的標本塊組織面研磨成光滑均勻且與玻璃載片平行的平面，露出所需觀察的組織及植入物。對于帶有金屬植入物的組織標本塊，研磨速度要慢，砝碼選擇要小，從320目砂紙開始逐步研磨，確保拋光后金屬面與組織面薄厚一致[每次更換砂紙前組織面要用數顯千分尺測量至少4個點位（每個點位之間的測量值之差應≤5 μm），取平均值]。值得注意的是，為了確保磨片機的穩(wěn)定，要提前開機預熱空轉30 min；為了確保砂紙與磨盤貼合的更好更平整，砂紙需要提前在水中浸泡1～2 h，注意時間不宜過長，以免影響砂紙的鋒利度。制備好的組織塊基座見圖1。

2.6 附加平行載片

因樹脂載片不易碎，且與Technovit 7210VLC 精密粘合劑及組織標本塊結合得更好，所以應選擇樹脂載片作為平行載片，但其成本及淘汰率較高，且因采購到的樹脂片工藝水平差異較大，易出劃痕，導致表面不平整（誤差在5 μm 以上），所以要求精確測量其厚度。

圖1 組織標本塊的基座

將平行載片吸附在EXAKT 平行粘合壓片機上，然后用Technovit 7210VLC 精密粘合劑粘在平行組織面上（注意防止產生氣泡），打開光源，開始固化，時間為10～15 min，注意粘時要確保取粘合劑的器械、組織面、平行載片的表面的清潔，見圖2。

需要注意的是，由于7210VLC 粘合劑呈弱酸性，接觸含“鎂”等活性金屬時會產生大量氣泡，因此，不能被用于粘接該類樣品[4]。

圖2 附加平行載片的結構

2.7 計算膠的厚度

為保證最終制片的準確厚度，需使用數顯千分尺精確測量并計算出附加好平行載片后7210VLC 粘合劑的厚度，測量及計算方法見圖3。

圖3 組織塊的結構

需要注意的是，測量的所有步驟都應保持在同一溫度下，且根據組織面的大小選擇測量點位數量，組織面越大則測量點位應越多，一般為4～5個點，求平均值。

2.8 切片

使用E300CP 硬組織切片機，將有樹脂平行載片的一面切割成厚度為100～200 μm 的切片，且不宜太薄，因切片后續(xù)要經過多道砂紙逐步研磨，太薄會給每道砂紙研磨的控制帶來困難；亦不宜太厚，因有的樣本塊可能需要制備多張切片，太厚會浪費包含植入物的組織。由于設備的參數設置并不能精準地控制切片的厚度，所以，切片的厚度在很大程度上取決于個人經驗的積累。

切片帶鋸和支撐輪組裝是否到位及選擇的帶鋸是否合適都會直接影響切片的平整度，如果切片前后凹凸不平，則考慮是由于設備組裝不到位或帶鋸不夠鋒利導致。在切割過程中，切割臺下有50～100 g 的推動力，在切片過程中任何外力都會導致切割面凹凸不平。當帶有金屬植入物的組織或組織塊較大時，帶鋸的轉速和擺動速度均要慢，且應選擇較小的推動力。

2.9 磨片

用數顯千分尺測量、計算組織的準確厚度，根據所測量厚度調定需在磨片機上研磨的厚度；當切片很薄時，可省略320目砂紙研磨，選擇500、800、1 200、2 500、4 000目的砂紙磨片至需要的厚度為止；需要注意的是，研磨到2 500 目時要格外小心，因為到2 500 目時切片的厚度已接近預設值，進一步需要的研磨量已很難由設置參數來控制，需依賴自身經驗去設定研磨時間，極端情況下，受研磨時冷卻水的影響，可能會出現片子被機器緊密吸附，導致組織和植入物在極短時間內被全部磨掉的情況。4 000目砂紙起拋光的作用，設定時間可以長一些，可為7～10 min 或更長。

2.10 染色

常用染色法包含HE 染色法、甲苯胺藍染色法及亞甲基藍-酸性品紅染色法，我們可以根據所需觀察的指標選擇不同的染色方法。HE 染色法的步驟與常規(guī)石蠟切片HE染色法基本一致（去掉脫蠟部分），但固化后的樹脂不易上色，可根據組織標本塊種類、厚度、大小的不同來適當延長染色時間，如普通石蠟切片HE 染色中蘇木素染色時間需要5～10 min，而硬組織磨片需要20～30 min 或更長；待每個步驟完成后，均需于鏡下觀察染色效果，若效果不佳，則需復染并根據經驗調整時間；不同的組織、不同厚度的磨片染色時間存在差異，只有及時進行鏡下觀察及持續(xù)積累經驗，才能不斷提升硬組織磨片染色的質量。

3 討論

與石蠟切片技術比較，硬組織切磨技術的優(yōu)點：（1）不用脫鈣，眾所周知，脫鈣程度不好把控，時間過長可引起組織細胞皺縮而造成組織結構不完整[5]，對于一些含鈣較高的醫(yī)用材料，脫鈣可破壞組織結構，影響其生物學評價及定量分析；（2）可以做到原位切片，對于一些植入后局部反應試驗，很多醫(yī)用金屬或其他材料（如鈦、鎂等金屬材料、帶螺紋的牙科種植體及一些不規(guī)則的醫(yī)用材料等），石蠟切片無法做到原位切片。硬組織切磨技術的缺點：（1）成本高，設備、帶鋸、砂紙、樹脂及樹脂載片等主要耗材均需專機配套使用，價格較石蠟切片高很多；（2）周期相對長，一張標準的硬組織磨片從固定到浸透到最終制作成片再到染色至少需要2個月，如組織標本塊過大或過厚還需再延長時間；（3）步驟繁多，每一步都需精雕細刻，時間無法省略或縮短；（4）硬組織磨片相對較厚，普通石蠟切片可以控制在3～5 μm，但硬組織制片終厚度在20～50 μm，由于其材料的特殊性和設備的不穩(wěn)定性，過薄的切片不易染色且易造成組織及樣品缺失。

總之，硬組織切磨技術是醫(yī)療器械生物安全性評價的重要技術手段。制作一張標準的硬組織磨片周期跨度很長，全程操作步驟均不可逆，且每個硬組織標本塊最多只可切幾張切片，每一張都很珍貴，因此，每一步操作都要到位，謹慎細心，精準控制時間，避免失誤；此外，操作技術人員需要不斷地學習和實踐，積累豐富的制片經驗。

［參考文獻］

［1］ 中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. GB/T 16886.6-2015.醫(yī)療器械生物學評價第6部分：植入后局部反應試驗[S/OL]（2015-12-10）[2017-04-01].http：//www.doc88.com/p-5955645962139.html.

［2］ 葛麗華，楊晶.硬組織磨片的制備[A].中華醫(yī)學會病理學分會2011年全國病理技術新進展研討會論文匯編[C].南寧：中華醫(yī)學會，2011：158-159.

［3］ 席越.骨組織病理解剖學技術[M]. 2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：185-186.

［4］ 王東勝.硬組織制片技術要領及應用[DB/OL].全國第二屆硬組織切磨技術應用培訓班.

［5］ 齊進，黃萍，張連方，等. EXAKT 切磨系統(tǒng)在帶金屬種植體軟硬組織切片中的應用[J].中國組織工程研究，2012，16（35）：6557-6558.