獼猴桃皮多酚對高脂膳食大鼠脂代謝紊亂的調節作用

蘇天霞，袁敏蘭，周 艷，孫曉紅，張清海

（1.貴州醫科大學公共衛生學院，環境污染與疾病監控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學食品科學學院，貴州 貴陽 550025）

隨著居民膳食結構中高熱量食物的比例不斷增加，以及日常活動趨于靜態化，導致超重和肥胖的發病率逐年上升[1]，且呈現出年輕化、不可控的趨勢[2]。據報道，長期的高脂膳食（high fat diet，HFD）會導致能量的攝入和消耗不平衡，多余的能量轉變為脂肪儲存在體內，最終導致機體發生肥胖和脂代謝紊亂[3]，繼而大大增加心血管疾病、高脂血癥、2型糖尿病等多種慢性代謝性疾病的發病率，嚴重影響患者的生活質量[4]。因此，研究如何有效預防和改善脂代謝紊亂的方法受到全社會的關注。當前預防肥胖、調節脂代謝紊亂的方法存在安全性低、療效不佳等問題[5-6]。故從天然產物中開發安全、高效的藥物已成為研究的焦點。植物多酚是自然界最常見的一大類植物活性物質，因其安全性高，且具有抗氧化、抗炎、抗病毒、調節糖脂代謝等多種生物活性而頗受關注[7-9]。

大量研究報道，多種植物多酚在預防和調節脂代謝紊亂過程中發揮重要作用。Fernando等[10]研究證實蔓越莓多酚具有改善肥胖小鼠的糖脂代謝、緩解肝脂肪變性的作用；Kim等[11]以1 g/kgmb的劑量灌胃小鼠匙羹藤多酚4 周，發現小鼠的體質量以及血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平與高脂組比顯著降低，腹部脂肪含量顯著下降；Nilanjan等[12]研究發現辣木種子多酚提取物能夠消耗高脂膳食小鼠體內多余的能量，維持能量代謝平衡，從而改善肝脂代謝紊亂，預防肥胖的發生。但是植物酚類化合物的組成和含量因其種類、產地、部位等不同存在較大差異[13-14]，而目前國內外關于獼猴桃皮多酚的研究大多集中在對多酚的提取、成分分析、體外抗氧化等方面[15-16]，基于動物實驗探索獼猴桃皮多酚的功能報道較少，這在一定程度上影響了獼猴桃皮多酚的開發利用。因此，本實驗以SD大鼠為研究對象，探索獼猴桃皮多酚對高脂膳食大鼠脂代謝的影響及可能的作用機制，為獼猴桃皮多酚是否可作為調節脂代謝紊亂的功能因子提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性健康SD大鼠，體質量（160.00±15.46）g，生產許可證號：SYXK（黔）2018-0001，由貴州醫科大學實驗動物中心提供。大鼠基礎飼料購于貴州醫科大學實驗動物中心，高脂飼料含80%（質量分數，下同）基礎飼料、9.5%豬油、0.5%膽固醇、10%蛋黃粉[17]。

TG、TC、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、游離脂肪酸（free fatty acids，FFA）、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒 南京建成生物工程研究所；動物組織總RNA提取試劑盒（TRIzol試劑） 江蘇碧云天生物技術有限公司；去基因組反轉錄試劑盒、反轉錄聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 上海索萊寶生物公司；其他試劑均為分析純；引物由上海生工生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表 1 PCR引物設計序列Table 1 Primer sequences used for PCR

獼猴桃皮多酚提取物實驗室自制（獼猴桃皮原料由貴州修文三圣金果公司提供），獼猴桃皮經過烘干、粉碎后，采用實驗室前期優化的提取方法提取獼猴桃皮多酚[18]，提取條件為：甲醇體積分數為60%、料液比1∶30、超聲提取時間20 min、溫度60 ℃、功率450 W，提取完成后進行過濾、旋轉蒸發，最終凍干得到獼猴桃皮多酚的提取物，經Folin-Ciocalteu法檢測獼猴桃皮多酚提取物中多酚質量分數為65.4%。動物實驗時獼猴桃皮多酚提取物配制成總酚質量濃度為10 mg/mL溶液，通過高效液相色譜法測得獼猴桃皮中含7 種多酚物質（單位為mg/mL），分別為原兒茶酸6.45、表兒茶素1.60、七葉亭0.53、沒食子酸0.086、綠原酸0.082、對-香豆酸0.074、兒茶素0.068。

1.2 儀器與設備

ABIViiA7熒光定量PCR儀 美國ABI公司；MK-3酶標儀、冷凍離心機 美國Thermo公司；721可見分光光度計 上海精密科學儀器公司；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；超聲清洗器 江蘇昆山美美超聲儀器有限公司；數顯式電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器公司；光學顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養及分組

將40 只SPF級雄性SD大鼠用正常飼料預飼喂1 周后，按體質量隨機分為5 組，每組8 只：正常組（NC組）、高脂組（HF組）和獼猴桃皮多酚低（50 mg/（kgmb·d），LKP組）、中（75 mg/（kgmb·d），MKP組）、高（100 mg/（kgmb·d），HKP組）劑量干預組。正常組飼喂普通飼料，其余4 組飼喂高脂飼料。連續灌胃9 周，每日一次，獼猴桃皮多酚干預組按照相應的濃度進行灌胃，NC組、HF組灌一定體積蒸餾水。

飼養條件：實驗大鼠飼養于清潔級動物房，同室分籠，每組3 籠，每籠3～4 只，環境溫度控制在（23±2）℃，相對濕度55%～58%，12 h/12 h晝夜循環光照，保持飼養環境衛生。實驗期間所有動物均自由攝食和飲水，每周同一時間稱量并記錄體質量。

1.3.2 樣本的采集及處理

9 周后實驗結束、大鼠宰殺前禁食12 h，稱體質量，用10%水合氯醛給大鼠進行麻醉，麻醉狀態心臟取血入非抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清，-80 ℃保存備用。立即解剖大鼠，在冰浴上迅速取肝、內臟脂肪，包括腸系膜、腹周、睪周、腎周脂肪，精確稱質量并記錄，肝臟用冷生理鹽水洗滌，洗凈血水，去掉筋膜血管等附著物，用濾紙拭干，稱質量。取100 mg左右肝臟組織置于TRIzol試劑中，剪碎，-80 ℃保存，用于總RNA的提取；取部分肝組織浸入10%中性多聚甲醛溶液中固定，4 ℃保存備用。剩余肝組織液氮冷凍后，-80 ℃保存。

1.3.3 大鼠生長指標的測定

1.3.4 血生化水平的測定

采用試劑盒法測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA的濃度，具體方法按照試劑盒的說明書進行。

1.3.5 肝臟指標的測定

1.3.5.1 肝臟組織形態學觀察

HE染色：甲醛固定超過24 h以上的肝臟組織進行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸入石蠟包埋，預冷后切片（厚度5 μm）[19]。嚴格按照試劑盒說明書將切片進行HE染色，滴少許中性樹膠封片，自然通風晾干，收集并進行鏡檢（400×），觀察肝臟組織形態變化。

1.3.5.2 肝臟脂代謝相關基因mRNA表達量測定

TRIzol法提取肝臟中的總RNA，加入適量DEPC水稀釋，通過測定溶液A260nm/A280nm確定所得RNA的純度，比值在1.8～2.0時用于下一步實驗。嚴格按照去基因組反轉錄試劑盒說明書操作，消除提取產物中的基因組DNA，并將RNA逆轉成cDNA。

按照試劑盒說明書在冰上配制10 μL反應體系。該體系包含熒光染料TB Green Premix ExTaqII（2×）5 μL，正向及反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA溶液1 μL，滅菌水3 μL。設置3 個復孔，使用ABIViiA7熒光定量PCR儀進行擴增，擴增條件參考童鑫等的方法[20]，并有所改動，收集熒光信號時，退火溫度為58 ℃。擴增條件如下：預變性95 ℃、3 min；95 ℃、15 s，58 ℃、30 s（收集熒光信號），40 個循環。熔解曲線分析：溫度65～95 ℃，每30 s讀1 次。以β-actin為內參基因，mRNA相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.4 數據統計分析

所有實驗數據均用SPSS 21.0軟件進行統計分析。多組間差異性比較采用單因素方差分析，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05有顯著性意義。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃皮多酚對大鼠生長指標的影響

圖 1 獼猴桃皮多酚對大鼠生長指標的影響Fig. 1 Effect of kiwifruit peel polyphenols on growth indexes in rats

由圖1A可知，適應性喂養1 周后，各組大鼠的初始體質量均為（207±12）g，組間無顯著性差異（P＞0.05）；隨著實驗時間的延長，大鼠體質量逐漸增加。第9周時，HF組大鼠的體質量為（524.50±28.70）g，與NC組相比具有顯著差異性（P＜0.05）；獼猴桃皮多酚干預后，MKP和HKP大鼠的體質量與HF組相比顯著下降（P＜0.05），與NC組無顯著差異性（P＞0.05），說明獼猴桃皮多酚的干預可以緩解高脂膳食引起的體質量增加（圖1B）。如圖1C所示，對各組大鼠腸系膜脂肪、腹部脂肪、睪腎周脂肪質量進行分析，結果發現，各組腹部脂肪質量之間無顯著性差異（P＞0.05）；HF組腸系膜脂肪、睪腎周脂肪質量顯著高于NC、MKP、HKP組（P＜0.05）。如圖1D、E所示，對不同組間脂肪指數、肝指數進行分析，發現HF組脂肪指數、肝指數顯著高于NC組（P＜0.05）；與HF組相比，干預組的肝指數以及MKP、HKP組脂肪指數顯著下降（P＜0.05），并且存在劑量效應關系。說明獼猴桃皮多酚能有效緩解高脂膳食引起的大鼠體質量、肝質量、脂肪質量增加。

2.2 獼猴桃皮多酚對大鼠血生化水平的影響

表 2 獼猴桃皮多酚對大鼠血生化指標的影響Table 2 Effect of kiwifruit peel polyphenols on blood biochemical parameters in rats

由表2可知，與NC組相比，HF組大鼠血清TG、TC、LDL-C、FFA水平顯著升高（P＜0.05），HDL-C水平顯著下降（P＜0.05），說明高脂膳食會導致大鼠血脂異常。與HF組相比，3 個干預組的TG、LDL-C水平顯著降低（P＜0.05）；MKP、HKP組的TC、FFA水平顯著降低（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。結果表明，獼猴桃皮多酚可正向調節高脂喂養導致的脂代謝異常，其中HKP組的調節效果最好。

2.3 獼猴桃皮多酚對大鼠肝組織形態以及脂代謝相關基因mRNA表達水平的影響

2.3.1 獼猴桃皮多酚對大鼠肝組織形態的影響

由圖2可見，與NC組相比，HF組大鼠肝臟出現嚴重的脂質蓄積現象，呈現彌漫性脂肪變性，肝索紊亂，肝細胞腫脹，內含數量、大小不一的脂肪空泡；經過獼猴桃皮多酚的干預，LKP、MKP組肝脂質蓄積現象、細胞腫脹的程度、脂肪空泡的數量較HF組得到明顯的改善；NC組、HKP組大鼠肝細胞形態趨于一致，結構清晰完整、排列緊密，細胞內偶見少量脂肪空泡。

圖 2 肝臟組織形態學觀察、HE染色結果（400×）Fig. 2 Hepatic histomorpholgical observation (400 ×)

2.3.2 獼猴桃皮多酚對大鼠脂代謝相關基因mRNA表達水平的影響

圖 3 獼猴桃皮多酚對大鼠肝臟脂代謝相關基因mRNA表達水平的影響Fig. 3 Effect of kiwifruit peel polyphenols on the mRNA expression of lipid metabolism related gene in liver of rats

如圖3所示，與NC組相比，HF組大鼠肝臟脂肪合成相關基因ACC、FASmRNA表達顯著上調（P＜0.05），脂肪氧化分解相關的基因CPT-1、PPAR-αmRNA表達顯著下調（P＜0.05）。經過獼猴桃皮多酚干預后，與HF組相比，LKP、MKP、HKP組大鼠肝臟脂肪合成基因ACC、FASmRNA表達顯著下調（P＜0.05）；而與脂肪分解相關的CPT-1mRNA的表達顯著上調（P＜0.05），M K P、H K P 組的P PA R-αm R NA 的表達顯著上調（P＜0.05）；結果表明獼猴桃皮多酚能夠通過調控與脂肪合成和脂肪氧化分解相關的基因來改善高脂膳食導致的脂代謝紊亂，且在一定劑量范圍內，與獼猴桃皮多酚的攝入量呈正相關。

3 討 論

獼猴桃是一種營養價值豐富、具有獨特風味的水果，深受世界人民喜愛。近年來，我國獼猴桃產業發展迅速，種植面積和年產量均居世界第一[21]。但在獼猴桃產業飛速發展的同時也存在原料浪費嚴重現象，如獼猴桃皮這一主要加工副產物約占獼猴桃原料質量的30%，富含多種營養成分，具有很大的開發價值；但目前未得到充分利用，主要作為廢渣處理，這不僅浪費資源，還給環境增加負荷[22]。因此，開發相關的高附加值產品是一個急需解決的問題。

本研究顯示，獼猴桃皮多酚的干預能夠抑制高脂膳食大鼠體質量、肝質量、腸系膜脂肪、睪腎周脂肪質量的增加，且存在劑量反應關系，HKP組高脂膳食大鼠體質量、腸系膜脂肪、睪腎周脂肪質量的降低效果最顯著。而劉清清[23]利用與獼猴桃皮同源的獼猴桃籽多酚提取物對高脂大鼠進行干預，結果也顯示，獼猴桃籽多酚提取物可顯著降低大鼠體質量，且存在劑量反應關系。長期的高脂膳食是脂質代謝紊亂最主要的原因，最直觀的表現就是血脂異常，肝臟作為脂質代謝的主要場所，在脂質的吸收、合成、分解和轉運過程中發揮十分重要的作用[24]。一般來說，血脂的變化常常預示著肝臟脂肪合成和分解的變化。已有研究表明植物多酚可顯著改善機體的血脂水平，抑制肝臟脂肪的積累[25]。本實驗結果發現通過獼猴桃皮多酚的干預可顯著改善因HFD造成的肝臟脂肪空泡增多，肝脂過度蓄積的現象；同時顯著降低高脂大鼠血清TG、TC、LDL-C、FFA水平，顯著提高血清HDL-C水平；且隨著獼猴桃皮多酚灌胃劑量的增加，其改善肝脂蓄積的效果越明顯，調節脂質代謝的作用越強。

植物多酚可通過調控脂代謝合成和分解相關基因，改善肝脂代謝紊亂[26]。Huang Kang等[27]用高脂飼料喂養雄性SD大鼠，并用高、低兩種劑量的綠原酸對其進行灌胃，實驗結果表明綠原酸能有效降低FAS、ACC表達，抑制肝臟脂肪的合成；同時還可上調CPT-1的表達，促進脂肪酸氧化。本實驗結果發現通過獼猴桃皮多酚的干預，同樣可顯著下調高脂大鼠肝臟脂肪合成相關基（ACC、FAS）的表達；顯著上調脂肪分解相關基因（PPAR-α、CPT-1）的表達，進而實現對脂代謝紊亂的正向調控。ACC是脂肪酸合成限速酶，在調節能量代謝和控制肥胖發展方面起著重要的作用，其催化脂肪酸合成的第一步反應，即乙酰輔酶A羧合成丙二酰輔酶A[28]；FAS是ACC下游的另一個脂肪酸合成限速酶，在脂肪酸合成中起到關鍵的作用，機體脂肪沉積所需的脂肪酸大多是由FAS催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A轉變而成，其在肝臟組織中的表達較高[29]。本研究中ACC和FAS的mRNA表達顯著下調，說明獼猴桃皮多酚可以下調脂肪合成相關基因，在轉錄水平上抑制肝臟脂肪的合成，進而抑制血脂的升高。PPAR-α是過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）中的一個亞型，在肝臟的脂質代謝過程中發揮重要作用，它能夠調控許多線粒體脂肪酸氧化相關酶的表達，刺激脂肪酸β氧化，從而改善脂代謝紊亂狀況，維持脂質代謝平衡[30]。CPT-1是脂肪酸氧化的限速酶，其表達直接受到PPAR-α的調控；它可使長鏈的乙酰輔酶A進入線粒體基質內，參與三羧酸循環，促進脂肪酸β氧化[31]。獼猴桃皮多酚通過上調PPAR-α和CPT-1的表達，在轉錄水平刺激β氧化，降低脂肪酸的水平，抑制TG合成；同時PPAR-α還可催化TG水解為游離脂肪酸FFA和單酰甘油，提高血清中HDL-C的濃度[32]。

綜上所述，本研究從動物水平證明了獼猴桃皮多酚具有預防肥胖、改善脂代謝紊亂的作用，其作用機制與抑制生脂基因的表達，促進脂質分解基因的表達有關。提示獼猴桃皮多酚可作為預防肥胖、調節脂代謝紊亂的功能因子，為指導獼猴桃皮的精深加工利用提供了新的思路。結果對于脂代謝紊亂的預防和控制具有非常重要的研究價值和廣闊的應用前景。