硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用

郭 都，趙宇陽，王瑞霞，王 碩，夏效東，石 超

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100）

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是一種新興的食源性致病菌，直至2008年才被科學定義和分類[1]。阪崎克羅諾桿菌是一種革蘭氏陰性、無芽孢、周身鞭毛的條件性致病菌[2]。該菌廣泛分布于奶粉、水果以及蔬菜等食品中，流行病學研究表明嬰幼兒奶粉是其可能的傳播途徑[3]。它可導致新生兒或早產兒出現危及生命的腦膜炎、菌血癥以及壞死性小腸結腸炎等疾病，致死率高達80%[4]。即使此類由阪崎克羅諾桿菌感染引起的相關疾病被治愈，患者仍存在患有神經性發育遲緩、腦積水、四肢癱瘓等嚴重后遺癥的風險[5]。因此，預防及控制阪崎克羅諾桿菌的感染對于保障嬰幼兒健康具有重要意義。

使用抗生素是治療和預防致病菌感染常見的方法，然而隨著耐藥菌株的出現，一些抗生素對這些菌株不再有效[6]。近年來，將植物源活性物質用于控制由致病菌引起的感染成為研究熱點[7]。硫辛酸是一種天然的抗氧化劑，它能夠螯合金屬、消除活性物質從而修復細胞的氧化損傷。最初，硫辛酸被認為是一種維生素，廣泛存在于菠菜、西蘭花、番茄、豌豆、豆芽以及米糠中，其在人體血清中質量濃度約為16 mg/L[8-9]。研究表明硫辛酸對于糖尿病、肝損傷、動脈粥樣硬化等疾病有一定的治療潛力，已被一些國家作為膳食補充劑用于防治上述疾病[10]。研究表明，硫辛酸可通過改變阪崎克羅諾桿菌胞內pH值、降低胞外ATP、使細胞膜電位發生去極化從而抑制阪崎克羅諾桿菌[9]。此外，Kubra等[11]發現4 mmol/L硫辛酸對銅綠假單胞菌PAO1生物被膜形成的抑制率為28%。然而，硫辛酸對于其他細菌的抑制效果和機理鮮有報道。本實驗旨在探究硫辛酸對于阪崎克羅諾桿菌體外感染能力的抑制作用。

基于以上研究背景，本實驗通過評價硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌運動能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入腸上皮細胞能力以及在巨噬細胞中存活及增殖能力的影響，共同探究硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用，以期為硫辛酸作為膳食補充劑預防或控制由阪崎克羅諾桿菌引起的相關食源性疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544、29004和12868購于美國模式培養物集存庫。阪崎克羅諾桿菌分離菌株6-16、15-7和18-11由西北農林科技大學食品科學與工程學院食品微生物安全實驗室從嬰幼兒奶粉及米粉中分離得到[12]。人克隆結腸腺癌上皮細胞（Caco-2）、小鼠巨噬細胞（RAW 264.7）購于武漢大學細胞保藏中心。

硫辛酸（純度≥98%） 成都曼斯特生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptone soya agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soya broth，TSB）培養基北京陸橋技術有限公司；Dulbecco’s modified Eagle’s medium（DMEM）細胞培養液 美國Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 以色列Biological Industries公司；慶大霉素 美國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（純度≥99.5%）天津市科密歐化學試劑有限公司；其他所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

微生物全自動生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司；5 8 0 4 R 低溫冷凍離心機 德國E p p e n d o r f公司；HF90 CO2恒溫培養箱 上海力申科技儀器有限公司；GHX-9050B-2細菌恒溫培養箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；Model 680酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及菌液制備

將凍存于-80 ℃冰箱的阪崎克羅諾桿菌平板劃線于TSA培養基上并置于37 ℃恒溫培養箱培養12 h進行活化。隨后挑取單菌落接種于TSB培養基中，將接種了阪崎克羅諾桿菌的培養液置于37 ℃恒溫搖床中培養12 h（130 r/min）。將培養后的菌懸液4 ℃、5 000×g離心5 min，去除上清液，隨后使用pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次。最后用PBS重新懸浮菌體沉淀，并調整菌懸液在600 nm波長處的光密度值（OD600nm）為0.50±0.05，使菌液濃度約為108CFU/mL，備用。

1.3.2 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌最小抑菌濃度的測定

硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定參考Chen Huaiqiong等[13]所用的肉湯稀釋法，并略有修改。具體方法如下：使用TSB培養基將1.3.1節所得菌液濃度調整至5×105CFU/mL。隨后使用DMSO配制硫辛酸溶液，將配制好的硫辛酸溶液溶解于TSB培養基中，利用等倍稀釋法配制不同濃度的硫辛酸溶液，并與上述菌液等體積混合使得硫辛酸終質量濃度為5.00、2.50、1.25、0.625、0.312 5、0 mg/mL（對照組，CK）（DMSO體積分數為0.5%）。將混合好的細菌-硫辛酸混合液以每孔200 μL的體積加入至96 孔板中。同時，實驗設置含有體積分數0.5% DMSO的TSB培養基作為背景空白對照組以扣除溶劑對OD值造成的影響。此時，將樣品置于酶標儀中測定各組樣品在630 nm波長處的OD值。隨后，將樣品置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后再次測定OD630nm。經培養24 h后，OD值變化小于0.05所對應最小的硫辛酸質量濃度即為硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌的MIC。

1.3.3 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌亞抑制濃度的測定

硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌亞抑制濃度（sub-minimum inhibitory concentration，SIC）的測定參照Shi Chao等的方法[14]。按1.3.1節的方法制備阪崎克羅諾桿菌菌懸液。向百孔板每孔中加入125 μL菌懸液（約106CFU/mL），隨后每孔加入125 μL使用TSB培養基配制的硫辛酸溶液，使硫辛酸質量濃度分別為480、240、120、60、30、15、7.5、3.75 μg/mL。實驗設置不添加硫辛酸的菌懸液作為對照組（CK），并設置TSB培養基作為背景空白對照組。將樣品置于微生物全自動生長曲線分析儀中，于37 ℃下每隔1 h測定24 h內各孔樣品在波長600 nm波長處的OD值，繪制生長曲線，并選擇對阪崎克羅諾桿菌生長無明顯抑制作用的濃度作為硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌的SIC。

1.3.4 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌運動能力的影響

硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌泳動及群集運動能力影響的測定參照Li Guanghui等[15]的方法。首先，配制泳動營養平板（含0.3%（質量分數，下同）瓊脂LB肉湯）和群集營養平板（含0.5%瓊脂、0.5%葡萄糖LB肉湯），將配制好的溶液加熱煮沸至完全溶解，121 ℃高壓滅菌。待培養基溫度降低至45 ℃左右時，向其中加入硫辛酸，使硫辛酸終質量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL并充分混勻后倒入培養皿（直徑90 mm）。待培養基冷卻后，吸取5 μL 1.3.1節中制備的菌懸液分別接種至泳動平板和群集平板中央，于37 ℃分別培養7 h和18 h。隨后使用凝膠成像系統進行拍照，并記錄阪崎克羅諾桿菌向周圍運動所形成的面積。

1.3.5 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力的影響

參考Naves等[16]的方法，按1.3.1節的方法制備阪崎克羅諾桿菌菌懸液，并使用TSB調節菌懸液OD600nm＝1（濃度約為109CFU/mL）。隨后，向上述菌懸液中加入硫辛酸溶液使其終質量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL。隨后，將各組樣品轉移至96孔細胞培養板中，每孔250 μL。于25 ℃下培養48 h后，使用酶標儀測定各孔樣品在630 nm波長處的OD值。隨后，吸除菌液并使用無菌水將各孔漂洗一次，烘干后使用質量分數1%結晶紫溶液對生物被膜進行染色并使用無菌水漂洗未與生物被膜結合的結晶紫染料，烘干后使用體積分數33%冰乙酸溶液溶解生物被膜-結晶紫復合物。最后，測定每孔樣品在570 nm波長處的OD值。使用OD570nm與OD630nm的比值表示阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力指數（specific biofilm formation，SBF），其中OD570nm反映生物被膜形成量，OD630nm反映菌懸液中細菌的數量。

1.3.6 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細胞能力的影響

硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細胞能力影響的測定參照Amalaradjou等[17]的方法略有修改。將對數生長期的Caco-2細胞以1×105個/mL的濃度接種于24 孔細胞培養板中，于37 ℃、5% CO2環境下培養18 h，并使用PBS輕柔清洗兩次。菌懸液制備同1.3.1節，向其中添加硫辛酸溶液使得各組終質量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL。隨后將各組樣品置于37 ℃搖床培養6 h（130 r/min）后，4 ℃、5 000×g離心5 min，并使用PBS清洗2 次。使用含有10%（體積分數）FBS的DMEM培養液調整菌液濃度為106CFU/mL。隨后，將制備好的阪崎克羅諾桿菌接種于準備好的Caco-2細胞中，使得感染復數（multiplicity of infection，MOI）為10，600×g離心5 min，置于37 ℃、5% CO2環境下培養1 h。

黏附實驗：去除細胞上清液，使用PBS輕柔清洗3 次。向每孔加入0.1%（體積分數）Triton X-100，置于4 ℃孵育20 min以裂解細胞。收集所有液體進行10 倍梯度稀釋并涂布于TSA平板上，將樣品置于37 ℃培養24 h后讀數。黏附率以處理組黏附菌量與CK組黏附菌量的比值表示。

侵入實驗：去除細胞上清液，使用PBS輕柔清洗一次。向每孔加入含有100 μg/mL慶大霉素的1%FBS-DMEM培養液，于37 ℃、5% CO2條件下培養30 min。隨后去除細胞上清液，使用PBS輕柔清洗3 次后，向每孔加入0.1% Triton X-100，置于4 ℃孵育20 min以裂解細胞。收集所有液體進行10 倍梯度稀釋并涂布于TSA平板上，將樣品置于37 ℃培養24 h后讀數。侵入率以處理組侵入菌量與CK組侵入菌量的比值表示。

1.3.7 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌在小鼠巨噬細胞RAW 264.7中存活及增殖能力的影響

本實驗參照Shi Chao等[18]的方法。將對數生長期的RAW 264.7細胞以1×105細胞/mL的濃度接種于24 孔細胞培養板中于37 ℃、5% CO2環境下培養12 h，使用無菌PBS輕柔清洗3 次。菌懸液制備同1.3.1節，向其中添加硫辛酸溶液使得各組終質量濃度分別為0（CK）、30、60 μg/mL。隨后將各組樣品置于37 ℃搖床培養6 h（130 r/min）后，離心（5 000×g，5 min，4 ℃）并使用PBS清洗2 次。使用10% FBS-DMEM培養液調整菌懸液濃度為106CFU/mL。隨后，將制備好的阪崎克羅諾桿菌接種于準備好的RAW 264.7細胞中，使得MOI為10，于37 ℃、5% CO2條件下培養45 min后，吸除孔板中的液體，并使用PBS清洗1 次；向每孔加入含有100 μg/mL慶大霉素的1% FBS-DMEM培養液，于37 ℃、5% CO2環境下培養30 min。去除細胞上清液，使用PBS清洗一次。向每孔加入含有10 μg/mL慶大霉素的1% FBS-DMEM培養液，于37 ℃、5% CO2環境下分別培養0、24、48、72 h。于對應的時間點，取出孔板并去除每孔細胞上清液，使用PBS清洗3 次。向每孔加入0.1% Triton X-100，置于4 ℃孵育20 min以裂解細胞。收集所有菌體進行10 倍梯度稀釋并涂布于TSA平板上，將樣品置于37 ℃培養24 h后讀數。

1.4 數據統計與分析

實驗至少進行3 次重復，數據以平均值±標準差表示，使用SPSS 19.0軟件處理實驗數據，結果采用t檢驗進行顯著性比較。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌的MIC

表 1 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌的MICTable 1 MICs of LA against C. sakazakii strains

如表1所示，硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌3 株標準菌株及3 株分離菌株的MIC均為5.00 mg/mL。因此，硫辛酸可有效抑制阪崎克羅諾桿菌。由于阪崎克羅諾桿菌標準菌株ATCC 29544具有泳動群集運動能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入腸上皮細胞能力以及在巨噬細胞中存活及增殖能力等毒力因子表型和基因學特征[19]，因此選擇菌株ATCC 29544作為后續研究對象。

2.2 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的SIC

圖 1 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544生長曲線的影響Fig. 1 Effect of LA on the growth curve of C. sakazakii ATCC 29544

由圖1可知，480、240、120 μg/mL硫辛酸可顯著抑制阪崎克羅諾桿菌的生長。當硫辛酸質量濃度低于60 μg/mL時，在24 h內，硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌的生長曲線沒有明顯影響，因此，本研究選擇60、30 μg/mL作為硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌的SIC。

2.3 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544運動能力的影響

如圖2所示，未使用硫辛酸處理的阪崎克羅諾桿菌其泳動圈面積為（24.91±0.72）cm2，經30、60 μg/mL硫辛酸處理后，阪崎克羅諾桿菌泳動圈面積分別極顯著下降至（21.06±0.80）cm2和（18.40±1.04）cm2（P＜0.01）。因此，硫辛酸可以抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動能力，且呈現濃度依賴效應。

圖 2 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544泳動能力的影響Fig. 2 Effect of LA on swimming motility of C. sakazakii ATCC 29544

圖 3 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544群集能力的影響Fig. 3 Effect of LA on swarming motility of C. sakazakii ATCC 29544

由圖3可知，30 μg/mL的硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌群集運動面積無顯著影響（P＞0.05）。60 μg/mL的硫辛酸可顯著減小阪崎克羅諾桿菌的群集運動圈面積，其面積極顯著下降至CK組的71.41%（P＜0.01）。

2.4 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544生物被膜形成能力的影響

如圖4所示，結果表明硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌的生物被膜形成能力。未經硫辛酸處理的阪崎克羅諾桿菌SBF為2.31±0.26，經質量濃度為15 μg/mL的硫辛酸處理后，阪崎克羅諾桿菌SBF極顯著下降至1.94±0.06（P＜0.01）。經質量濃度為30、60 μg/mL的硫辛酸處理后，其生物被膜形成量分別極顯著下降為CK組的82%和79%（P＜0.01）。

圖 4 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544生物被膜形成能力的影響Fig. 4 Effect of LA on biofilm-forming capacity of C. sakazakii ATCC 29544

2.5 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544黏附及侵入Caco-2細胞能力的影響

圖 5 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544黏附（A）及侵入（B）Caco-2細胞能力的影響Fig. 5 Effect of LA on the ability of C. sakazakii ATCC 29544 to adhere (A)and invade (B) Caco-2 cells

由圖5A可知，SIC（60、30 μg/mL）的硫辛酸可極顯著抑制阪崎克羅諾桿菌對Caco-2細胞的黏附能力（P＜0.01）。經30、60 μg/mL的硫辛酸作用后，阪崎克羅諾桿菌對Caco-2細胞的黏附量分別下降至CK組的70.93%和53.27%。在侵入實驗中（圖5B），30 μg/mL的硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌侵入細胞能力無顯著影響（P＞0.05）。60 μg/mL的硫辛酸可將侵入Caco-2細胞的阪崎克羅諾桿菌數量極顯著下降至CK組的72.00%（P＜0.01）。綜上所述，硫辛酸可有效抑制阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544黏附及侵入Caco-2細胞的能力。

2.6 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544在RAW 264.7細胞中存活及增殖能力的影響

由圖6可知，CK組中阪崎克羅諾桿菌在72 h內仍可在巨噬細胞中存活，并且在24～72 h內，阪崎克羅諾桿菌在巨噬細胞中存活并進行增殖。經質量濃度為30、60 μg/mL的硫辛酸處理后，阪崎克羅諾桿菌在72 h內在巨噬細胞中的存活量均有下降。且在72 h時，硫辛酸極顯著降低了阪崎克羅諾桿菌在巨噬細胞中的存活量（P＜0.01）。綜上所述，SIC的硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌在巨噬細胞RAW 264.7中存活及增殖能力。

圖 6 硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544在巨噬細胞RAW 264.7中存活及增殖能力的影響Fig. 6 Effect of LA on survival and replication of C. sakazakii ATCC 29544 in RAW 264.7 cells

3 討 論

細菌的感染能力與多種因素有關，其中菌體運動性、生物被膜形成能力、黏附及侵入宿主腸上皮細胞能力以及在巨噬細胞中存活及增殖能力等被認為是阪崎克羅諾桿菌感染宿主、造成宿主嚴重的系統性感染的重要原因[20]。本研究首先測定得出硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌3 株標準菌株和3 株分離菌株的MIC均為5.00 mg/mL（表1）。隨后確定硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544的SIC為30、60 μg/mL（圖1）。在此基礎上，本研究在不影響阪崎克羅諾腸桿菌存活及生長的條件下，從阪崎克羅諾桿菌運動能力、生物被膜形成能力、黏附及侵入宿主細胞能力以及在巨噬細胞中存活及增殖能力4 個方面，共同探究硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌感染能力的體外抑制作用。

細菌的運動性與其對宿主的感染能力有著密切的聯系，對其初步侵入并感染宿主細胞起到關鍵作用[21]。細菌依靠鞭毛運動定向侵入及作用于宿主細胞，因而運動性是致病菌一項重要的毒力因子，抑制致病菌的運動性是控制致病菌感染的有效途徑[22]。本研究中，硫辛酸在SIC（30、60 μg/mL）下可抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動及群集運動能力（圖2、3）。前期研究結果表明，檸檬醛與百里醌在SIC下也可抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動及群集運動能力[18-19]。類似地，100 μg/mL質量濃度的姜黃素可抑制副溶血性弧菌、哈維氏弧菌以及創傷弧菌的泳動和群集運動能力[23]。Bai Jinrong等證明0.312 5、0.625、1.25 mg/mL質量濃度的莽草酸可抑制金黃色葡萄球菌的運動能力[24]。在本研究中，硫辛酸抑制了阪崎克羅諾桿菌的泳動及群集運動能力，從而一定程度上降低了阪崎克羅諾桿菌在侵染初期對宿主細胞的定向侵入能力。

細菌的運動性在細菌黏附植物或動物組織表面過程中起到了重要的作用。細菌可通過這種能夠附著在有生命或無生命材料表面的能力形成生物被膜，從而為細菌提供一定的物理保護屏障，使其能夠抵抗多種外界壓力，如熱、滲透壓、消毒劑以及抗生素等[25]。阪崎克羅諾桿菌可附著于塑料、玻璃、不銹鋼以及硅膠等介質表面生長并形成生物被膜，該生存方式能夠抵抗消毒劑的清除作用，增加易感人群感染的幾率[7,26]。因此，抑制阪崎克羅諾桿菌生物被膜的形成能力有利于降低人體感染該菌的風險。本研究利用結晶紫可與生物被膜中胞外聚合物結合的特性，評價硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力的影響（圖4）。類似地，Brackman等[27]使用經典結晶紫染色法證明肉桂醛可降低弧菌生物被膜的形成量。Kang Jiamu等[28]利用結晶紫染色法證明0.25～2.00 mg/mL質量濃度的沒食子酸可顯著抑制福氏志賀菌生物被膜形成量。Fan Qiuxia等[29]利用場發射掃描電子顯微鏡定性觀察得到CoQ0可有效降低單增李斯特菌形成過程中的生物被膜黏附菌量。在本研究中，SIC的硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌生物被膜形成能力，從而一定程度上降低其對外界環境的抵抗能力。Hartmann等[30]研究表明，鞭毛的缺失可大大降低細菌的附著能力，因此，硫辛酸對細菌運動能力及生物被膜形成能力的抑制作用是否是通過降低阪崎克羅諾桿菌鞭毛合成相關基因的表達來實現的，有待進一步探究。

致病菌對宿主細胞的黏附作用被認為是多數感染性疾病的起因，有研究表明，致病菌的黏附作用可使其依附于宿主細胞表面，避免被宿主的清潔機制清除[31]。同時黏附作用可使致病菌進一步侵入宿主細胞及組織進而引發宿主的感染[20,32]。經口攝入的阪崎克羅諾桿菌可通過黏附腸上皮細胞、穿越腸道屏障、侵入血管和宿主免疫系統從而穿透血腦屏障破壞宿主體內環境穩態進而引起宿主嚴重的系統性感染[20]。因此，阪崎克羅諾桿菌黏附并侵入宿主腸上皮細胞是引發系統性感染的第一步。研究表明，阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544可黏附并侵入Caco-2細胞[33]。在本研究中，硫辛酸可有效抑制阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細胞的能力（圖5）。Amalaradjou等[17]證明肉桂醛可抑制阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入宿主細胞人小腸上皮細胞INT 407、Caco-2細胞、大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6及腦微血管內皮細胞BMEC細胞的能力。類似地，Li Guanghui等[15]發現SIC的安石榴苷可降低黏附及侵入人結腸癌細胞HT29的鼠傷寒沙門氏菌SL1344的菌量。研究表明，外膜蛋白OmpX和OmpA在阪崎克羅諾桿菌黏附宿主的過程中起到了重要的作用[34]。Shi Chao等[18]研究表明，百里醌可降低編碼外膜蛋白OmpX和OmpA的基因的轉錄水平，從而一定程度上抑制阪崎克羅諾桿菌對HT29細胞的黏附及侵入作用。在本研究中，硫辛酸可降低阪崎克羅諾桿菌侵襲宿主細胞的能力，從而在阪崎克羅諾桿菌引發宿主感染的最初環節降低阪崎克羅諾桿菌的感染能力。

阪崎克羅諾桿菌能夠在巨噬細胞內存活及增殖，這種能力使其能夠逃避宿主的免疫應答，并進一步引發宿主更深層次的感染[35]。研究表明，阪崎克羅諾桿菌在被人巨噬細胞U937吞噬后能夠繼續在細胞中存活至96 h，其在巨噬細胞中復制和存活的能力使其得到了免疫系統的保護并有利于疾病的進一步擴散[36]。本研究結果表明，硫辛酸可顯著降低阪崎克羅諾桿菌在巨噬細胞中的存活量及增殖量（圖6）。前期研究表明，檸檬醛能夠顯著抑制阪崎克羅諾桿菌在巨噬細胞RAW 264.7內的生存和復制能力[19]。類似地，Muyyarikkandy等[37]證明SIC的乳酸菌代謝產物可抑制腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌以及海德堡沙門氏菌在巨噬細胞中的存活能力。研究表明，阪崎克羅諾桿菌中的sod基因可編碼超氧化物歧化酶，以合成該酶與巨噬細胞中的活性氧發生中和反應，從而抵抗巨噬細胞的殺菌作用[17]。因此硫辛酸是否是通過降低sod等相關基因的表達來降低其對抗宿主免疫反應的能力，從而使其難以在體內進一步發展，還有待進一步探討。

綜上所述，硫辛酸在體外可抑制阪崎克羅諾桿菌的感染能力，有潛力作為膳食補充劑應用于食品控制由阪崎克羅諾桿菌引起的相關感染。然而，當硫辛酸作為膳食補充劑應用體內抑制阪崎克羅諾桿菌的感染能力時，硫辛酸在體內的代謝以及與食品中的一些營養素的相互作用從而可能會影響到其在體內對阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用。因此，在后續實驗中，將繼續探究硫辛酸在體內對阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用，進一步為硫辛酸作為膳食補充劑應用于食品中控制阪崎克羅諾桿菌的感染能力提供理論依據。

4 結 論

本研究探究了硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌感染能力的抑制作用。結果表明，硫辛酸對阪崎克羅諾桿菌具有一定的抑制效果，其對阪崎克羅諾桿菌的MIC為5.00 mg/mL；SIC的硫辛酸（30、60 μg/mL）可抑制阪崎克羅諾桿菌的泳動及群集運動能力、生物被膜形成能力；同時，SIC的硫辛酸可減弱阪崎克羅諾桿菌黏附及侵入Caco-2細胞的能力并降低其在巨噬細胞RAW264.7中存活及增殖的能力。本研究結果表明硫辛酸能夠減弱阪崎克羅諾桿菌的感染能力，這為硫辛酸作為膳食補充劑用于預防和控制由阪崎克羅諾桿菌引起的相關感染提供理論依據。