桑葉生物堿粗提物對D-半乳糖誘導的小鼠蛋白氧化損傷的改善作用

楊忠敏，沈以紅，黃先智，王祖文，丁曉雯,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400716；2.西南大學科技處，重慶 400716）

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）是機體的正常代謝產(chǎn)物，適量的ROS、RNS對維持生物體細胞正常的生理功能至關(guān)重要[1]。但當機體氧化系統(tǒng)和抗氧化防御系統(tǒng)的平衡遭到破壞時，機體內(nèi)會產(chǎn)生過量的高活性氧、氮分子（如ROS、RNS），導致機體產(chǎn)生氧化應激[2]。蛋白質(zhì)是機體一類重要的生物大分子，極易被高活性分子攻擊，使其氨基酸殘基發(fā)生變化，進而導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變[3]。已有研究表明，許多疾病如阿爾茨海默病[4]、尿毒癥[5]、帕金森病[6]等的發(fā)生與蛋白質(zhì)的氧化水平密切相關(guān)。

核因子E2相關(guān)因子2（nuclear erythroid related factor2，Nrf2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch like ECH-associated protein-1，Keap1）信號通路被認為是最重要的內(nèi)源性抗氧化通路。Nrf2是調(diào)節(jié)細胞對抗異源性物質(zhì)和氧化損傷的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控下游II相解毒酶和抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄活性進而增強抗氧化作用，而Keap1是Nrf2的調(diào)控因子[7]。在正常生理狀態(tài)下，細胞中Keap1與Nrf2結(jié)合在一起并抑制Nrf2的激活，當機體發(fā)生氧化應激時，Nrf2和Keap1分離，Nrf2被激活并與抗氧化反應元件相結(jié)合，進而激活靶基因的表達，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用[8]。

藥食兩用植物中存在的天然抗氧化劑對于預防氧化應激反應誘導相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。桑葉生物堿作為一類以1-脫氧野尻霉素為主的多羥基哌啶生物堿，已被證實具有降脂、降糖等作用[9-10]。筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)桑葉生物堿在體外模擬胃腸消化體系中具有較強的抗氧化潛力[11]，同時也證實了該化合物在小鼠體內(nèi)能增強小鼠的抗氧化能力，對小鼠體內(nèi)大分子物質(zhì)的氧化損傷具有改善作用[12]。但目前針對桑葉生物堿改善蛋白氧化損傷特別是作用機理的研究鮮見報道。因此，本實驗采用D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）誘導建立小鼠氧化損傷模型，然后給實驗小鼠灌胃不同劑量的桑葉生物堿，在前期研究的基礎(chǔ)上從Nrf2/Keap1信號通路出發(fā)深入探討桑葉生物堿在體內(nèi)對蛋白氧化損傷的改善作用及機理，為桑葉生物堿的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，為防御機體蛋白氧化損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

基礎(chǔ)飼料、SPF級昆明種小鼠（60 只，4 周齡，平均體質(zhì)量為20 g左右）均由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-0003。

桑葉粉末 重慶市蠶業(yè)科學技術(shù)研究院；桑葉生物堿為西南大學農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室自制[11]，采用硅鎢酸沉淀法[13]測定總生物堿質(zhì)量分數(shù)為93.57%。

D-Gal（純度≥99%）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）（純度≥98%） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；蛋白羰基（protein carbonyl，PCO）、晚期蛋白氧化產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、醌氧化還原酶1（NAD(P)H quinine oxidoreductase 1，NQO1）酶聯(lián)吸附免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒南京建成生物工程研究所；高純總RNA快速提取試劑盒北京百泰克生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix ExTaqTMII（Til RNaseH Plus）試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Symergy H1酶標儀 美國基因有限公司；811DK高速冷凍離心機 德國Eppendorf AG公司；KQ5200DB超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；T100T型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction）儀、CFX96實時熒光定量PCR（real-time PCR，qPCR）儀、NanoDropND-2000C微量紫外分光光度計、GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng) 美國Thermo公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物預實驗

根據(jù)參考文獻[14]開展動物預實驗，建立動物實驗的飼養(yǎng)方法，確定桑葉生物堿低、中、高劑量分別為50、100、200 mg/kgmb，實驗為期8 周。

1.3.2 動物分組及模型建立

60 只雄性SPF級昆明種小鼠，實驗前適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分出10 只為正常對照組，連續(xù)腹腔注射與造模組等量的生理鹽水；其余50 只小鼠連續(xù)腹腔注射D-Gal（1 000 mg/kgmb）20 d，構(gòu)造氧化應激模型。以造模組、正常對照組小鼠血清中MDA、SOD水平是否存在顯著差異作為判定指標。

正常對照組小鼠繼續(xù)灌胃生理鹽水；將造模成功的小鼠隨機分為模型對照組（灌胃生理鹽水）、陽性藥物組（灌胃200 mg/kgmbGSH）以及桑葉生物堿低、中、高劑量組，每組10 只。實驗期間，小鼠每天稱體質(zhì)量1 次，并根據(jù)體質(zhì)量變化按照0.1 mL/10 gmb每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃8 周。

小鼠按照西南大學實驗動物保護和使用規(guī)則飼養(yǎng)，實驗期間室內(nèi)通風條件良好，控制動物房溫度為（23±2）℃、相對濕度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00 a.m.～21∶00 p.m.），所有小鼠均喂飼基礎(chǔ)飼料，自由覓食、飲水。

1.3.3 樣本采集

8 周灌胃結(jié)束后，各實驗組小鼠禁食不禁水12 h，摘取小鼠眼球取血于肝素鈉采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，上清液即為血漿，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩２裳戤吅螅瑢嶒炐∈箢i椎脫臼處死，快速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血漿PCO、AOPP、3-NT的水平及SOD、GSH-Px、NQO1的活力測定

均按照試劑盒說明書提供的方法進行操作。

1.3.5 肝組織SOD、GSH-Px、NQO1、Nrf2、Keap1mRNA表達的測定

按照RNA提取試劑盒的方法提取肝臟組織總RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增。取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL作為反應模板，進行qPCR擴增，反應體系10 μL。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，如表1所示。qPCR條件：95 ℃、4 min預變性；95 ℃、15 s變性，60℃、30 s退火，共39 個循環(huán)。以β-actin作內(nèi)參基因，分別測定肝組織SOD、GSH-Px、NQO1、Nrf2、Keap1的相對表達量，結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

表 1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉生物堿對小鼠蛋白氧化損傷的影響

PCO是蛋白質(zhì)分子被ROS攻擊后產(chǎn)生的，A OPP是氯氧化劑次氯酸作用于蛋白質(zhì)而形成的含雙酪氨酸的交聯(lián)產(chǎn)物，兩者均可作為蛋白氧化損傷的敏感指標[5,15]。而RNS攻擊蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基，使蛋白質(zhì)發(fā)生硝化反應產(chǎn)生3-NT，也是氧化應激指標之一[16]。

表 2 桑葉生物堿對D-Gal誘導小鼠血漿PCO、AOPP、3-NT水平的影響（n＝10）Table 2 Effects of mulberry leaf alkaloids on PCO, AOPP and 3-NT levels in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠PCO、AOPP、3-NT水平分別增加了57.93%、180.52%、161.27%（P＜0.01），表明模型組小鼠發(fā)生了明顯的蛋白氧化損傷。與模型組相比，陽性藥物組PCO、AOPP、3-NT水平分別減少了36.52%、63.36%、60.22%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組PCO、AOPP、3-NT水平分別減少了36.43%、61.81%、58.13%（P＜0.01），且恢復到與正常對照組無顯著性差異水平（P＞0.05），表明桑葉生物堿對氧化應激小鼠蛋白氧化損傷有較好的改善作用。

2.2 桑葉生物堿對小鼠抗氧化酶活力的影響

機體存在著內(nèi)源性的抗氧化防御系統(tǒng)，抗氧化酶SOD、GSH-Px是其重要的組成部分，它們可通過分解ROS/RNS而對機體組織起到保護作用[17]。

表 3 桑葉生物堿對D-Gal誘導小鼠血漿SOD、GSH-Px活力的影響（n＝10）Table 3 Effects of mulberry leaf alkaloids on SOD and GSH-Px activity in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表3 可知，與正常對照組相比，模型組小鼠SOD、GSH-Px活力分別下降了34.13%、63.88%（P＜0.01），表明模型組小鼠的抗氧化酶系統(tǒng)活力大大降低，對氧化應激的改善能力下降。與模型組相比，陽性藥物組SOD、GSH-Px活力分別升高50.05%、173.07%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組SOD、GSH-Px活力分別升高了48.89%、167.17%（P＜0.01），且恢復到與正常對照組無顯著性差異水平（P＞0.05）。表明桑葉生物堿能使氧化應激小鼠抗氧化酶活力逐漸恢復，進而達到清除機體過量自由基的作用。

2.3 桑葉生物堿對小鼠II相解毒酶活力的影響

II相代謝酶是細胞在遭受異源性物質(zhì)侵襲發(fā)生氧化應激損傷或細胞毒性、致癌性等可能性增加時發(fā)揮保護細胞作用的蛋白酶，又稱II相解毒酶或II相抗氧化酶。NQO1是重要的II相解毒酶之一。

表 4 桑葉生物堿對D-Gal誘導小鼠血漿NQO1活力的影響（n＝10）Table 4 Effects of mulberry leaf alkaloids on NQO1 activity in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表4可知，與正常對照組相比，模型組小鼠NQO1活力下降了46.97%（P＜0.01），表明模型組小鼠保護細胞不被氧化損傷的能力大大減弱。與模型組相比，陽性藥物組NQO1活力升高了87.92%（P＜0.01）；桑葉生物堿高劑量組NQO1活力升高了85.12%（P＜0.01），也恢復到與正常對照組無顯著性差異水平（P＞0.05）。表明桑葉生物堿能改善氧化應激小鼠NQO1活力。

2.4 桑葉生物堿對小鼠抗氧化損傷酶mRNA表達的影響

SOD、GSH-Px、NQO1是機體內(nèi)抗氧化應激的重要組成酶，且主要表達靶器官是肝臟組織[18]。如果機體發(fā)生氧化應激，則SOD、GSH-Px、NQO1的mRNA表達量將會減少。本研究考察了桑葉生物堿是否從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)上述3 種酶的活力水平。

2.4.1 桑葉生物堿對小鼠肝臟SOD1、SOD2和GSH-PxmRNA表達的影響

圖 1 桑葉生物堿對小鼠肝臟SOD1（A）、SOD2（B）和GSH-Px（C）mRNA表達的影響Fig. 1 Effects of mulberry leaf alkaloids on SOD1 (A), SOD2 (B) and GSH-Px (C) mRNA expression in mouse liver

由圖1 可知，與正常對照組相比，模型組小鼠SOD1、SOD2和GSH-PxmRNA表達分別下降了50.71%、51.22%、59.06%（P＜0.01）。與模型組相比，桑葉生物堿高劑量組SOD1、SOD2和GSH-PxmRNA表達分別上升了96.96%、94.26%、116.71%（P＜0.01），且恢復到與正常對照組無顯著性差異水平（P＞0.05），說明桑葉生物堿通過調(diào)控SOD1、SOD2和GSH-Px的mRNA表達水平使得SOD、GSH-Px活性水平升高進而清除機體自由基，防止蛋白遭受自由基攻擊導致氧化損傷。

2.4.2 桑葉生物堿對小鼠肝臟NQO1mRNA表達的影響

圖 2 桑葉生物堿對小鼠肝臟NQO1 mRNA表達的影響Fig. 2 Effects of mulberry leaf alkaloids on NQO1 mRNA expression in mouse liver

由圖2可知，與正常對照組相比，模型組小鼠NQO1mRNA表達水平下降了52.46%（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物組NQO1mRNA表達水平增加了102.16%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量組NQO1mRNA表達水平增加了101.51%（P＜0.01），且恢復到與正常對照組無顯著性差異水平（P＞0.05）。說明桑葉生物堿通過調(diào)控NQO1的mRNA表達水平使得NQO1活性逐漸恢復。

2.5 桑葉生物堿對小鼠肝臟Nrf2、Keap1 mRNA表達的影響

Nrf2是亮氨酸轉(zhuǎn)錄因子家族成員中最強的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在肝臟、腎等參與代謝和解毒的組織中表達，Keap1是Nrf2的特異性受體[19]。為考察桑葉生物堿在機體中改善蛋白氧化損傷的調(diào)節(jié)機制，本研究測定Nrf2、Keap1在肝臟中的mRNA表達水平。

圖 3 桑葉生物堿對小鼠肝臟Nrf2（A）和Keap1（B）mRNA表達的影響Fig. 3 Effects of mulberry leaf alkaloids on Nrf2 (A) and Keap1 (B)mRNA expression in mouse liver

由圖3可知，與正常對照組相比，模型組小鼠Nrf2mRNA表達水平下降了40.46%（P＜0.01），Keap1mRNA表達水平增加了56.85%（P＜0.01）。與模型組相比，陽性藥物組Nrf2mRNA表達水平增加了66.55%（P＜0.01），Keap1mRNA表達水平降低了34.72%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量組Nrf2mRNA表達水平增加了63.01%（P＜0.01），Keap1mRNA表達水平降低了33.54%（P＜0.01），且恢復到與正常對照組無顯著性差異水平（P＞0.05）。研究結(jié)果說明桑葉生物堿能通過調(diào)控Nrf2/Keap1信號通路進而增加下游靶基因SOD、GSH-Px及NQO1mRNA表達，改善機體抗蛋白氧化損傷的能力。

3 討 論

蛋白質(zhì)分子在機體中占有特殊地位，是機體細胞的基本構(gòu)成物質(zhì)，同時，它也是生物體中很多重要的代謝物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)的載體[20]。Stadtman等[21]研究表明，機體中的高活性分子攻擊氨基酸分子中的自由氨基或亞氨基，最終生成相應的羰基衍生物，其中金屬離子催化氧化系統(tǒng)是產(chǎn)生PCO的主要途徑。AOPP是自由基攻擊血清蛋白的氧化作用產(chǎn)生的雙酪氨酸蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，也是蛋白氧化損傷的特異性標志之一[22]。酪氨酸硝基化會嚴重影響機體細胞信號的傳導和代謝酶的調(diào)節(jié)，其產(chǎn)物3-NT不僅能作為一些疾病的生物標志物，也能促進疾病的發(fā)生和發(fā)展[23]。大量研究已表明，一些天然產(chǎn)物能夠抑制自由基對蛋白質(zhì)的氧化損傷[24]，如張月等[25]研究表明，辣椒堿能抑制蛋白質(zhì)硝基化及PCO水平。本研究結(jié)果表明，經(jīng)桑葉生物堿調(diào)控后，已發(fā)生了氧化應激的小鼠其PCO、AOPP及3-NT水平可逐漸恢復到與正常對照組無顯著性差異的水平（P＞0.05），表明桑葉生物堿與其他生物堿化合物作用一樣，對機體的蛋白氧化損傷具有較好的改善作用，且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。

機體內(nèi)存在一套內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)，其對機體的氧化應激應答是動態(tài)的，在一定程度下可與氧化應激形成平衡。SOD、GSH-Px是抗氧化系統(tǒng)中重要的內(nèi)源性抗氧化酶：SOD可通過歧化反應將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2，之后GSH-Px可將H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)樗瑥亩Ｗo生物大分子免受氧化應激損傷[26-27]。NQO1是真核細胞中普遍存在的一類黃素類蛋白酶，它能催化醌類及其衍生物還原并使其毒性降解，從而阻止它們進一步參與機體的氧化還原反應和產(chǎn)生ROS，進而減輕機體氧化應激反應[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，200 mg/kgmb桑葉生物堿調(diào)控后，小鼠血漿中SOD、GSH-Px、NQO1活力及mRNA表達水平均顯著升高，且恢復到與正常對照組、陽性藥物組無顯著性差異的水平（P＞0.05），提示桑葉生物堿能從轉(zhuǎn)錄水平恢復機體抗氧化酶的活力，這與彭曉蝶[29]、郝麒麟[30]等研究結(jié)果相一致。

為進一步探討桑葉生物堿對蛋白氧化損傷的改善作用，本實驗對其作用的分子機制進行了深入研究。Keap1/Nrf2是在機體氧化應激過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用的信號通路。Nrf2能與抗氧化反應元件結(jié)合激活特定的下游靶基因轉(zhuǎn)錄，且Nrf2水平與SOD、GSH-Px、NQO1的表達呈正相關(guān)[31]。Keap1是69 kDa的細胞質(zhì)蛋白伴侶分子，是Keap1/Nrf2通路的主要調(diào)節(jié)器，它可根據(jù)細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)打開或者關(guān)閉Keap1-Nrf2-ARE通路[32]。大量研究表明，許多生物堿化合物（如野百合堿、毛果蕓香堿等）對Nrf2/Keap1具有調(diào)控作用[33]。本研究結(jié)果表明桑葉生物堿可以顯著下調(diào)Keap1mRNA表達，上調(diào)Nrf2mRNA表達，表明桑葉生物堿對Nrf2/Keap1通路有較好的調(diào)控作用。

綜上所述，桑葉生物堿可能通過激活Keap1/Nrf2信號通路，增加下游SOD、GSH-Px及NQO1mRNA的表達，從而提高SOD、GSH-Px及NQO1活力，促進機體ROS/RNS清除，達到改善生物體內(nèi)蛋白質(zhì)分子氧化損傷的目的。