蝦青素對高脂HepG2細胞及高脂膳食飼喂C57BL/6J小鼠血脂代謝的影響

刁翠茹，王 靜，閆 勇，劉 東，張曉寒，王 浩

（天津科技大學食品工程與生物技術學院，食品營養與安全重點實驗室，天津 300457）

高脂血癥主要是指血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）或甘油三酯（triglyceride，TG）水平升高[1]。大量流行病學研究發現，血脂水平、血漿膽固醇水平升高程度與動脈粥樣硬化及高脂血癥的嚴重程度有一定的關系，特別是與冠心病、腦中風、心腦血管疾病的死亡率呈正相關[2-4]。而心血管疾病仍然是全球人類死亡的主要原因，在美國所有患病死亡的患者中，約1/3死于心血管疾病[5]。肝臟是合成與分解TG的重要場所，當脂肪合成與分解失衡或代謝運轉異常，超于機體可控調節范圍時，就會引起TC、TG水平升高，進一步誘發高脂血癥[6]。

蝦青素是一種葉黃素類胡蘿卜素，存在于許多微生物、海洋動物、酵母和鳥類羽毛中，被認為是生物圈中分布最廣泛的脂溶性葉黃素[7-9]。蝦青素不僅可以抑制脂質過氧化和低密度脂蛋白氧化，還可以減少高脂膳食飼喂大鼠中血清TG含量[9-11]。蝦青素已被證明具有多種生物學功能，如抗脂質過氧化和抗炎等[12-14]。研究表明，蝦青素的抗氧化性能有助于預防癌癥、糖尿病和心血管疾病[13-14]。其抗氧化活性高于大多數抗氧化劑，包括VC、VE、β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素[15]。目前國內外研究集中于蝦青素對酒精性脂肪肝的預防[16-17]，而對HepG2細胞降血脂功能的研究尚鮮見報道。因此，本實驗以高脂HepG2細胞及高脂膳食喂養的C57BL/6J小鼠為模型，探討蝦青素對血脂代謝的影響，為蝦青素在保健食品領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1動物、材料與試劑

SPF級雄性C57BL/6J小鼠40 只，體質量（20±2）g，許可證號：No.11400700309252，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

蝦青素油（質量分數19.64%） 云南愛爾康生物技術有限公司；TC、TG測定試劑盒和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒 中生北控生物科技股份有限公司；TRIzol試劑、cDNA反轉錄試劑盒、SYBR Green染料 寶生物工程（大連）有限公司；引物 蘇州金唯智生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

MyCycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、MyiQ2實時熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Multiskan-FC型酶標儀 賽默飛世爾儀器（上海）有限公司；752型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Neofuge冷凍離心機 美國Thermo公司；G-box凝膠圖像采集分析系統 英國Syngene公司；7890A氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 油酸誘導HepG2細胞中脂滴含量的測定

細胞培養及種板操作參考實驗室已有方法[18]，細胞在6 孔板中培養24 h貼壁；棄去培養基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗一次，選取4、8、16 μmol/L蝦青素為藥物處理終濃度，選取誘導HepG2細胞脂肪堆積的油酸終濃度為250 μmol/L，同時處理12 h，棄去培養基，PBS清洗兩次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS潤洗兩次，加入終質量濃度為2 mg/L油紅O染色40 min，PBS潤洗3 次，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照；每孔加入1 mL異丙醇溶解，將孔內溶液全部轉于1.5 mL EP管中，取1 mL異丙醇溶液作對照，于510 nm波長處測定吸光度，以吸光度反映脂滴含量。

1.3.2 HepG2細胞中TG、TC含量的測定

細胞在6 孔板中培養24 h貼壁，選取4、8、16 μmol/L蝦青素為藥物處理終濃度，選取誘導HepG2細胞脂肪堆積的油酸終濃度為250 μmol/L，同時處理12 h，棄去培養基，PBS清洗一次，細胞刮刀小心刮除細胞并溶于1 mL PBS中，混勻，離心（1 000 r/min、10 min），棄上清液，留細胞沉淀，用PBS清洗兩次，重復離心；收集細胞沉淀溶于0.3 mL PBS中，冰浴條件下超聲破碎（功率300 W、5 s/次、間隔30 s，重復5 次），勻漿。制備好的細胞樣品按照TG、TC說明書加樣，酶標儀測定吸光度[19]。

1.3.3 動物分組和飼喂

適應一周后將小鼠隨機分成4 組，每組10 只，分別為正常組、高脂組、低劑量蝦青素組和高劑量蝦青素組。動物飼料組成見表1。

動物飼養條件： 屏障系統動物房， 溫度（22±2）℃，相對濕度40%～60%，控制照明12 h/12 h晝夜循環。小鼠飼養8 周，實驗期間自由攝食攝水。實驗動物每2 d更換新糧。實驗8 周后，小鼠禁食不禁水12 h，CO2麻醉后取血、處死并解剖。血液4 ℃離心分離血清后-80 ℃保存。收集臟器，生理鹽水清洗后-80 ℃保存。結腸內容物裝入已滅菌離心管中，-80 ℃保存。

表 1 C57BL/6J小鼠飼料組成Table 1 Ingredients of diets for C57BL/6J mice g

1.3.4 血清中TC、TG和HDL-C水平的測定

血清中TC、TG和HDL-C濃度的測定參照試劑盒說明書進行，分別通過膽固醇氧化酶-過氧化物酶偶聯法、甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶偶聯法和直接法-過氧化氫酶清除法測定。非HDL-C濃度為TC與HDL-C濃度的差值。

1.3.5 病理學檢測

取相同位置肝臟，放入盛有體積分數為10%甲醛溶液的標本瓶中固定。24 h后將固定的肝組織脫水，石蠟包埋并切片。切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，先后用伊紅、蘇木精染色和復染，梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，中性樹膠封片，用顯微鏡觀察肝臟組織病理學變化。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測肝臟中脂肪合成相關基因表達水平

TRIzol法提取RNA，反轉錄得cDNA，-80 ℃保存。SYBRGreen法檢測基因表達水平，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因為內參基因，根據美國國家生物信息中心數據庫設計引物（表2）。反轉錄及實時熒光定量PCR參照試劑盒具體說明進行。具體操作方法參考文獻[20]。

表 2 C57BL/6J小鼠肝臟中與脂肪合成相關基因PCR引物Table 2 PCR primers for genes related to lipid synthesis in C57BL/6J mouse liver

1.3.7 糞中短鏈脂肪酸的測定

取每只小鼠新鮮糞便，以2-乙基丁酸作為內標，4 ℃放置過夜，加入濃硫酸酸化，再次漩渦振蕩，混勻后加入乙醚萃取，將上層有機相轉到另一離心管中，加入無水硫酸鈉，10 000×g離心30 min，取上層進行氣相色譜分析。短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）測定的前處理方法參見文獻[21]。氣相色譜條件：FID檢測器、19091N-133 HP-INNOWAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 22.0軟件分析，以平均值±標準差表示，用t檢驗法進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 蝦青素對油酸誘導HepG2細胞胞內脂滴含量的影響

圖 1 蝦青素對油酸誘導HepG2細胞內脂滴含量的影響（400×）Fig. 1 Effect of astaxanthin on the content of lipid droplets in HepG2 cells induced by oleic acid (400 ×)

圖 2 各實驗組的吸光度Fig. 2 Absorbance of five cell groups

由圖1、2可以看出，經油紅O染色后，胞內脂滴呈紅色，250 μmol/L油酸處理的細胞內脂滴含量明顯增多，染色后油酸高脂組中細胞異丙醇溶液的吸光度是正常組的3.67 倍，脂肪積累極顯著增加（P＜0.01）；8、16 μmol/L蝦青素組極顯著降低油酸誘導的細胞內脂滴含量（P＜0.01），吸光度相比于油酸高脂組分別降低41.13%和53.25%，證實蝦青素能有效抑制油酸誘導的脂滴沉積。

2.2 蝦青素對油酸誘導HepG2細胞內TG、TC含量的影響

圖 3 蝦青素對油酸誘導HepG2細胞內TG和TC含量的影響Fig. 3 Effect of astaxanthin on TG and TC contents in oleic acid induced HepG2 cells

由圖3可見，與正常組相比，油酸高脂組細胞內TG、TC含量極顯著升高（P＜0.01）；與油酸高脂組相比，經蝦青素處理后細胞內TG、TC含量極顯著降低，且呈濃度依賴趨勢，其中16 μmol/L蝦青素組TG、TC含量分別降低69.19%和63.69%（P＜0.01），表明蝦青素能夠明顯抑制油酸誘導的胞內TG、TC含量的增加。

2.3 蝦青素對C57BL/6J小鼠體質量、攝食量及臟器質量的影響

表 3 C57BL/6J小鼠體質量、攝食量及臟器質量（n＝10）Table 3 Body mass, feed intake and viscera mass of C57BL/6J mice in four groups (n= 10)

由表3可知，C57BL/6J小鼠飼喂8 周后，高脂組小鼠攝食量略低于正常組小鼠攝食量。但各組小鼠初始體質量、最終體質量及攝食量均無顯著性差異（P＞0.05）。與正常組相比，高脂組小鼠的肝臟質量極顯著增加（P＜0.01）；與高脂組比，高劑量蝦青素組肝臟質量顯著降低20.28%（P＜0.05）。

2.4 蝦青素對C57BL/6J小鼠血脂水平的影響

表 4 蝦青素對C57BL/6J小鼠血脂水平的影響（n＝10）Table 4 Effect of astaxanthin on serum lipid levels in C57BL/6J mice (n= 10)

由表4可知，高脂組的小鼠血清TC、TG、非HDL-C水平較正常組均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而HDL-C水平極顯著低于正常組（P＜0.01）。從血清TC水平看，與高脂組相比，蝦青素兩個劑量組的TC水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），高劑量蝦青素降低TC水平效果更明顯，使TC水平顯著降低30.1%。從血清TG水平看，與高脂組相比，蝦青素兩個劑量組的TG水平都顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），并且高劑量蝦青素組降低TG水平比低劑量蝦青素組提高10.6%，從血清HDL-C水平看，高劑量蝦青素組的HDL-C水平極顯著高于高脂組（P＜0.01），是高脂組的1.84 倍，說明蝦青素能升高小鼠血清中HDL-C水平。從血清非HDL-C水平看，與高脂組相比，低、高劑量蝦青素組的非HDL-C水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），分別降低了27.5%和42.2%。

2.5 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝細胞形態的影響

圖 4 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝細胞形態的影響（200×）Fig. 4 Effect of astaxanthin on hepatocyte morphology of C57BL/6J mice (200 ×)

由圖4可知，正常組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，少見脂肪變性，細胞結構清晰、胞質豐富，細胞核位于細胞中央，肝小葉內和血管周圍無炎癥細胞聚集；高脂組小鼠肝組織出現大面積脂肪變性，部分肝細胞胞質內充滿大脂滴，細胞核被較大的脂滴擠到一側；與高脂組相比，高劑量蝦青素組小鼠肝組織脂肪變性減輕，胞漿內脂滴數量減少、體積變小。正常組肝小葉結構正常且肝細胞排列整齊，與高劑量蝦青素組無明顯差異。高脂飲食導致小鼠肝脂肪變性，肝細胞中細胞壞死的數量增加且出現大量的脂肪空泡，使其明顯增大。結果表明，蝦青素能夠干預逆轉高脂引起的肝脂肪變性。

2.6 蝦青素對C57BL/6J小鼠糞中SCFAs的影響

圖 5 蝦青素對C57BL/6J小鼠糞便中SCFAs的影響Fig. 5 Effect of astaxanthin on fecal short-chain fatty acid level in C57BL/6J mice

對糞便樣品中3 種主要的SCFAs（乙酸、丙酸和丁酸）進行測定。由圖5可知，與正常組相比，高脂飲食誘導的3 種主要的SCFAs含量和總SCFAs含量均極顯著降低（P＜0.01），蝦青素干預后，3 種主要SCFAs的含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。并且高劑量蝦青素組乙酸、丙酸和丁酸的水平分別是高脂組的1.31、1.44 倍和1.47 倍。高劑量蝦青素組主要SCFAs的生成量是高脂組的1.40 倍。

2.7 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝臟中與脂肪合成相關基因表達水平的影響

圖 6 蝦青素對C57BL/6J小鼠肝臟中基因SREBP-1C、FAS、PPARa mRNA和CPT-1 mRNA表達的影響Fig. 6 Effect of astaxanthin on the mRNA expression levels of genes related to lipid synthesis in C57BL/6J mouse liver

由圖6可知，FAS是內源性脂肪酸合成的限速酶，在控制脂肪酸合成中具有重要作用。與高脂組相比，高劑量蝦青素干預組FASmRNA和SREBP-1CmRNA相對表達量均極顯著降低（P＜0.01），高劑量蝦青素組PPARαmRNA和CPT-1mRNA相對表達量提高。

3 討 論

血脂水平異常是動脈粥樣硬化和冠心病等心血管疾病的重要危險因素，因此將血脂水平維持在正常范圍對心血管疾病的預防和治愈有著重要意義[22]。研究表明高脂膳食會導致血脂異常，提高血清中TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇水平[23-24]。本實驗結果顯示，高脂膳食會引起肝細胞損傷，導致血清中TG水平增加，并在肝細胞內沉積，誘導肝臟中脂肪變性，給予一定劑量的蝦青素可以降低血清中TC、TG、非HDL-C水平，顯著升高HDL-C水平，對于調節血脂水平具有重要作用，并且通過降低脂肪含量改善由高脂膳食誘導的肝損傷。

此外，細胞實驗結果同樣顯示蝦青素能夠顯著降低細胞中脂肪含量和膽固醇水平。通過對肝臟中與脂肪相關基因表達水平的分析，可以看出高脂飲食導致FASmRNA和SREBP-1CmRNA表達水平顯著升高，給予蝦青素干預后逆轉這種改變。與高脂組的表達水平相比，FAS是催化脂肪酸從頭合成的關鍵酶，添加蝦青素干預，FASmRNA表達及其代表的內源性脂肪酸合成受到抑制[25]。SREBP-1C是調控TG合成相關的靶基因，并且能激活脂質合成[26]。與高脂組相比，蝦青素下調SREBP-1C基因及其靶基因FAS的表達，進而減少血清中內TG水平。CPT-1是脂肪酸β氧化的限速酶[27]，在脂肪代謝中發揮重要作用。PPARα是調控CPT-1mRNA表達的上游基因，PPARα被高脂飲食激活后將誘導CPT-1mRNA的表達，增加CPT-1的合成，促進脂肪酸β氧化，減少脂肪酸在肝細胞內的沉積，減輕肝細胞的脂肪變性[28]。結果顯示，高劑量蝦青素組小鼠的PPARαmRNA和CPT-1mRNA的表達增高，說明肝細胞在高脂飲食的誘導下，增強肝細胞內的脂肪酸β氧化，減輕肝細胞的脂肪性變。

SCFAs對能量代謝的多重影響已經被證明，SCFAs從腸腔被運輸到宿主的血液，并被機體的各器官吸收，其可在器官中作為底物或信號分子調節脂質代謝[29]。本實驗中，蝦青素促進主要SCFAs（乙酸、丙酸和丁酸）的產生，進而總SCFAs的產生增加，結果顯示蝦青素可通過SCFAs依賴途徑調節脂質代謝。

綜上所述，蝦青素可減少HepG2細胞中脂滴含量，調節高脂膳食飼喂C57BL/6J小鼠血脂水平和糞便中SCFAs的含量、改善肝臟病理狀態、調控肝臟中脂肪合成相關基因的表達并對血脂代謝起到調節作用，推測其具有較好的降血脂生物活性，其作用機制有待進一步研究。