鹽脅迫環境下發菜胞外多糖抗氧化作用及鎮痛抗炎活性

常相娜，陳雪峰，龔 頻，楊文娟，王 蘭，袁 霞，劉 寧

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

發菜（Nostocflagelliforme）又名發狀念珠藻，是一種陸生經濟藍藻[1]，發菜的營養價值很高，富含碳水化合物和蛋白質[2-3]。食用發菜對佝僂病、高血壓、產后血虧等疾病有改善作用，發菜還能通便利尿、清熱解毒、愈合傷口及降低血脂與膽固醇含量[4-6]。發菜可以在逆境（低溫、少水、高鹽等）下生存，因為發菜在生長代謝過程中分泌到細胞外的長鏈多糖，即發菜胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）一方面作為滲透調節物質發揮作用；另一方面會在細胞表面形成保護膜，保護機體蛋白質不失活。陳雪峰等[7]研究發現處于0.3 mol/L NaCl脅迫環境時，EPS的分泌量較常規非鹽脅迫培養細胞增加50.3%，且EPS的結構與部分理化性質也發生了改變[8]，說明EPS是應激性的代謝產物，可抵抗逆境脅迫。

賈士儒[9]與Kanekiyo[10-11]等對常規培養發菜產生EPS的活性進行了研究，結果表明無鹽脅迫發菜胞外多糖具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等活性。范華等[12]研究了鹽脅迫培養產生的發菜EPS的抗腫瘤活性及免疫活性，結果表明鹽脅迫發菜胞外多糖比無鹽脅迫發菜胞外多糖具有更好的抗腫瘤及免疫活性。陳雪峰等[7]報道了在BG-110（無氮）培養液、光照強度60 μmol/（m2·s）、NaCl濃度0.3 mol/L、連續培養6 d條件下獲得的鹽脅迫發菜胞外多糖具有抗氧化性。氧化應激與炎癥、高脂血癥的發生密切相關[13]，抗氧劑則能夠改善上述癥狀。陳雪峰等[7]的研究已證實鹽脅迫發菜胞外多糖的抗氧化性，推測發菜清熱解毒、降低血脂的功效與此有關。因此，本實驗擬進一步研究其他培養條件下鹽脅迫發菜胞外多糖抗氧化與抗炎鎮痛活性。以BG-11（含氮）培養液、光照強度30 μmol/（m2·s）、NaCl濃度0.3 mol/L、連續培養15 d條件下獲得的鹽脅迫發菜胞外多糖為研究對象，采用溫浴甩尾法及急性炎癥模型對發菜EPS的鎮痛抗炎作用進行初步研究，并結合研究發菜EPS體外的抗氧化作用，旨在為進一步開發利用發菜EPS提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級雄性昆明種小鼠，體質量（20±2）g，使用許可證號：SYXK2012（陜）2012-006，由西安交通大學醫學院提供。

發菜細胞 陜西科技大學微生物制造研究室；二甲苯、冰醋酸（分析純） 上海國藥集團；生理鹽水濟寧辰欣藥業股份有限公司；阿司匹林 石家莊石藥集團歐意藥業有限公司；醋酸地塞米松 河南國藥集團容生制藥有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（分析純） 美國Sigma公司；VC（分析純） 天津市天力化學試劑公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW型電子天平 德國Sartorius公司；UV-1100型紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；KW-1000D型數顯恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司；MGC-400HP光照培養箱 上海善志儀器設備有限公司；SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；H-1850R高速低溫離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發菜EPS的制備

將離心收集的對數期發菜細胞接種于含0.3 mol/L NaCl的BG-11培養液中，對照組不含NaCl。將細胞懸浮液置于光照培養箱中培養，光照強度30 μmol/（m2·s），光暗比12∶12（8∶00～20∶00光環境，20∶00～次日8∶00暗環境），白天溫度25 ℃，夜晚溫度10 ℃，連續培養15 d。參照陳雪峰等[14]的研究方法，過濾分離發菜培養液，Sevag法去除蛋白后收集培養液并濃縮，4 ℃醇沉，靜置24 h后經離心分離發菜EPS，并裝入透析袋，透析48 h去除小分子物質，冷凍干燥得發菜EPS。

1.3.2 發菜EPS體外抗氧化作用測定

1.3.2.1 羥自由基清除能力測定

準確吸取不同質量濃度的無鹽脅迫發菜胞外多糖與鹽脅迫發菜胞外多糖樣品溶液1.0 mL，4.5 mmol/L FeSO41 mL，4.5 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，混勻后加入4.4 mmol/L H2O21 mL啟動Fenton反應，以VC為對照，37 ℃水浴30 min后8 000 r/min離心3 min，于510 nm波長處測定吸光度[15]。羥自由基清除率按公式（1）計算。

式中：As為樣品吸光度；As0為樣品本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

式中：ΔA0為鄰苯三酚自氧化速率的吸光度；ΔA為加入樣品后鄰苯三酚的自氧化速率的吸光度。

1.3.2.3 DPPH自由基清除能力測定

參照陳雪峰等[17]方法并加以改進。準確吸取不同質量濃度無鹽脅迫發菜胞外多糖與鹽脅迫發菜胞外多糖樣品溶液1.0 mL，加入0.03 mg/mL DPPH溶液4.5 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min后，在517 nm波長處測定吸光度。以VC為對照。DPPH自由基清除率按公式（3）計算。

式中：As為樣品吸光度；As0為樣品本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3.3 小鼠溫浴甩尾法鎮痛實驗

將小鼠尾尖部（＜3 cm）浸入（50±0.5）℃的恒溫水浴中，記錄小鼠尾部自被放入水中起至出現甩尾的時間/s，此時間記為小鼠的基礎痛閾值。經預選確定基礎痛閾在2～10 s的小鼠進行溫浴甩尾實驗。合格小鼠96 只，隨機分成12 組，每組8 只。采用皮下注射和腹腔注射兩種方式給小鼠注射發菜EPS?？瞻讓φ战M注射0.9%的生理鹽水，陽性對照組為阿司匹林（30 mg/kgmb），再取4 組分別注射不同劑量發菜EPS（無鹽脅迫發菜胞外多糖組：30 mg/kgmb；鹽脅迫發菜胞外多糖組：低、中、高劑量分別為3、10、30 mg/kgmb）。每組小鼠在注射發菜EPS前（0 min）測定小鼠的基礎痛閾值。在注射發菜EPS后每隔10 min測量一次小鼠的痛閾值，記錄小鼠1 h內的痛閾值的變化，在測定過程中，痛閾值超過60 s按60 s計算[18]。

1.3.4 二甲苯致小鼠耳廓腫脹抗炎實驗

取雄性昆明小鼠60 只，隨機分成6 組，每組10 只，分別為生理鹽水空白對照組、地塞米松陽性對照組（3 mg/kgmb）與不同劑量發菜EPS組（無鹽脅迫發菜胞外多糖組：30 mg/kgmb；鹽脅迫發菜胞外多糖組：低、中、高劑量分別為3、10、30 mg/kgmb）。各組每天上午10時腹腔注射發菜EPS一次（0.1 mL/10 gmb），連續5 d。末次注射發菜EPS前30 min，于每只小鼠左耳正反兩面涂二甲苯30 μL，右耳為對照。致炎4 h后將小鼠頸部脫臼處死，沿耳廓剪下左、右兩耳，以8 mm打孔器在兩耳相同部位打下圓耳片，稱質量，按公式（4）、（5）分別計算耳腫脹度和腫脹抑制率[19-20]。

1.4 數據統計與分析

實驗結果均以平均值±標準差表示。數據處理采用SPSS 22.0統計軟件，使用ANOVA程序對數據進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發菜EPS體外抗氧化作用結果

2.1.1 羥自由基清除能力

圖 1 發菜EPS羥自由基清除能力Fig. 1 Scavenging capacity of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on ·OH radical

如圖1所示，無鹽脅迫發菜胞外多糖與鹽脅迫發菜胞外多糖均表現出對羥自由基的清除能力。與對照組相比，當發菜EPS質量濃度低于0.4 mg/mL時，羥自由基的清除能力從高到低為鹽脅迫發菜胞外多糖＞無鹽脅迫發菜胞外多糖＞對照組；當發菜EPS質量濃度為1～2 mg/mL時，羥自由基清除能力從高到低為對照組＞鹽脅迫發菜胞外多糖＞無鹽脅迫發菜胞外多糖?？傮w來看，鹽脅迫發菜胞外多糖的羥自由基清除能力優于無鹽脅迫發菜胞外多糖。當發菜EPS質量濃度達到0.8 mg/mL時，鹽脅迫發菜胞外多糖組的羥自由基清除率達到51.81%，此質量濃度下無鹽脅迫發菜胞外多糖組的羥自由基清除率為42.40%。伴隨發菜EPS質量濃度增大羥自由基的清除能力也逐漸增強，呈現出較為明顯的量效關系，但增幅逐漸減小。

圖 2 發菜EPS的·清除能力Fig. 2 Scavenging capacity of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on · radical

2.1.3 DPPH自由基清除能力

圖3所示為鹽脅迫發菜胞外多糖與無鹽脅迫發菜胞外多糖的DPPH自由基清除能力結果。相比于對照組，在測定質量濃度范圍下，DPPH自由基清除能力從高到低為對照組＞鹽脅迫發菜胞外多糖＞無鹽脅迫發菜胞外多糖?？傮w來看，鹽脅迫發菜胞外多糖與無鹽脅迫發菜胞外多糖對DPPH自由基清除能力低于對羥自由基與·。當發菜EPS質量濃度達到2 mg/mL時，鹽脅迫發菜胞外多糖與無鹽脅迫發菜胞外多糖的DPPH自由基清除能力分別為41.97%和36.46%，鹽脅迫發菜胞外多糖對DPPH自由基的清除能力優于無鹽脅迫發菜胞外多糖，且在實驗質量濃度范圍內，DPPH自由基清除能力與發菜EPS質量濃度呈現正相關。

圖 3 發菜EPS DPPH自由基清除能力Fig. 3 Scavenging capacity of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on DPPH radical

2.2 不同注射方式下發菜EPS的鎮痛作用

通過溫浴甩尾法評價EPS的鎮痛作用。0 min時各組小鼠痛閾值差異無統計學意義。由圖4可知，皮下注射發菜EPS后，除生理鹽水組外，皮下注射鹽脅迫發菜胞外多糖與無鹽脅迫發菜胞外多糖均有鎮痛效果（圖4A），各組小鼠在20、30、40 min時痛閾值均延長，表明發菜EPS具有顯著的鎮痛作用（P＜0.05）；由圖4B可知，皮下注射發菜EPS在30 min時所有劑量都表現出極顯著的鎮痛效果（P＜0.01）。伴隨發菜EPS在小鼠體內代謝，注射發菜EPS 50、60 min時，鎮痛作用不再顯著。注射相同質量濃度的發菜EPS溶液，鹽脅迫發菜胞外多糖鎮痛效果比無鹽脅迫發菜胞外多糖更好（圖4A）。由圖4B可知，鹽脅迫發菜胞外多糖低、中、高劑量痛閾值分別為4.92、5.04、4.99 s，結果表明皮下注射鹽脅迫發菜胞外多糖10 mg/kgmb發菜EPS溶液可顯著延長溫浴導致的小鼠甩尾反應時間，使痛閾值達到最大。圖5所示的腹腔注射發菜EPS鎮痛效果與皮下注射具有相類似規律，注射相同質量濃度的發菜EPS溶液，鹽脅迫發菜胞外多糖鎮痛效果比無鹽脅迫發菜胞外多糖更好（圖5A）；圖5B則表明不同劑量的鹽脅迫發菜胞外多糖相比較，低、中、高劑量最高痛閾值分別為5.12、5.42、5.17 s，中劑量10 mg/kgmb發菜EPS溶液效果最好。

圖 4 皮下注射發菜EPS對小鼠溫浴甩尾痛閾值的影響（n ＝8）Fig. 4 Analgesic effect of subcutaneous administration of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide (n = 8)

圖 5 腹腔注射發菜EPS對小鼠溫浴甩尾痛閾值的影響（n ＝8）Fig. 5 Analgesic effect of intraperitoneal administration of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide (n = 8)

結合圖4與圖5，比較皮下注射和腹腔注射兩種發菜EPS注射方式，相較于阿司匹林組，腹腔注射發菜EPS鎮痛效果優于皮下注射的鎮痛效果。皮下注射發菜EPS后，在30 min時所有劑量都表現出極顯著鎮痛效果，具有顯著鎮痛效果的時間區間為30～40 min，說明注射發菜EPS后，鎮痛效果逐步發揮，30 min時藥效最好。隨著時間延長，發菜EPS在體內代謝，鎮痛作用減弱。腹腔注射發菜EPS后，不同劑量的鹽脅迫發菜胞外多糖溶液均可延長小鼠溫浴甩尾的時間，20 min時所有劑量都表現出顯著鎮痛效果（P＜0.05），鎮痛效果發揮的主體時間為20～30 min。

2.3 發菜EPS的抗炎作用

圖 6 發菜EPS對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響（n ＝10）Fig. 6 Inhibitory effect of Nostoc flagelliforme extracellular polysaccharide on dimethylbenzene-induced mouse ear edema (n = 10)

如圖6A所示，相較于空白對照組，無鹽脅迫發菜胞外多糖組及鹽脅迫發菜胞外多糖組均能極顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹（P＜0.01），其中鹽脅迫發菜胞外多糖腫脹抑制率（43.11%）高于無鹽脅迫發菜胞外多糖的腫脹抑制率（32.88%），說明抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹方面，鹽脅迫發菜胞外多糖優于無鹽脅迫發菜胞外多糖。圖6B表明低劑量組可以顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹（P＜0.05），中劑量組與高劑量組均能極顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹（P＜0.01），且鹽脅迫發菜胞外多糖抗炎效果與劑量呈正相關，當鹽脅迫發菜胞外多糖劑量為30 mg/kgmb時，腫脹抑制率最高為43.11%。

3 討 論

發菜藻細胞在逆境脅迫條件下，形態、功能及抗逆活性物質等都會產生相應變化[21-23]。前期研究已經證實，鹽脅迫發菜胞外多糖與無鹽脅迫發菜胞外多糖相比，結構與理化性質發生了一定變化，進而可能導致功能活性發生改變，但具體發菜EPS的功能活性變化則有待進一步明確。

本實驗采用體外自由基清除能力實驗評價鹽脅迫發菜胞外多糖的抗氧化性能，實驗結果表明：相比于無鹽脅迫發菜胞外多糖，鹽脅迫發菜胞外多糖對羥自由基、·、DPPH自由基3 種不同類型自由基的清除能力均有所提高。自由基具有高氧化活性，化學性質非?；钴S，被認為是導致機體各類損傷的根本原因。鹽脅迫條件下發菜產生的EPS是一種應激性的代謝產物，合成受到逆境的影響，使得EPS的單糖組成發生改變。相較于無鹽脅迫發菜胞外多糖，鹽脅迫發菜胞外多糖中甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸及半乳糖的含量明顯提高，無鹽脅迫發菜胞外多糖的糖醛酸含量為6.37%，而鹽脅迫發菜胞外多糖為7.39%[8]，而糖醛酸被認為會增強酸性多糖的自由基清除活性，這一點在石斛多糖[24]、茶葉多糖[25]、金絲小棗多糖[26]及玉米須多糖[27]等多種多糖的體外抗氧化活性研究中都得到了證實。因此，鹽脅迫發菜胞外多糖具有更為突出的自由基清除能力，可能與其糖醛酸結構含量上升相關。然而，根據文獻報道，除單糖組成外，單糖聯動位置、多糖的三維結構都可能與多糖的抗氧化性有關[28]，因此，是否還有其他結構特征與鹽脅迫發菜胞外多糖的抗氧化活性相關仍需進一步研究。

本實驗通過溫浴甩尾實驗探討發菜EPS的抗炎鎮痛活性。鎮痛實驗結果顯示，發菜EPS能明顯延長溫浴甩尾的時間，其中鹽脅迫發菜胞外多糖鎮痛效果優于無鹽脅迫發菜胞外多糖，且腹腔注射（20 min）相較于皮下注射（30 min）起效速度快，鎮痛效果更顯著，產生上述差異的主要原因可能是兩種發菜EPS注射方式的代謝動力學差異。腹腔注射主要為腹膜吸收，腹膜的面積大且密布血管和淋巴管，因此腹膜有很強的吸收能力，每小時可吸收動物體質量3%～8%的液體，而皮下注射是經皮下結締組織間的毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環[29]，所以腹腔注射發菜EPS吸收速率和吸收量都優于皮下注射，這一結果與文獻[29-30]報道的趨勢一致。

二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗結果顯示，發菜EPS能明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹。相比于無鹽脅迫發菜胞外多糖，鹽脅迫發菜胞外多糖有更好的抗炎效果，且鹽脅迫發菜胞外多糖的抗炎作用呈現出一定的量效關系。炎癥是機體對損傷刺激所發生的防御反應，疼痛是機體受到傷害性刺激后所產生的一類保護性反應，疼痛與炎癥常同時發生，兩者都是臨床中常見問題。同時，自由基損傷是炎癥病理損傷的一個重要組成部分。本實驗研究結果表明鹽脅迫發菜胞外多糖具有良好的體外抗氧化活性，同時也具有體內鎮痛抗炎活性，但幾種活性之間的關聯性及鹽脅迫發菜胞外多糖在體內發揮活性的作用機理還有待深入研究。

本實驗采用體外自由基清除能力實驗評價鹽脅迫發菜胞外多糖的抗氧化性能，并通過溫浴甩尾和二甲苯致炎實驗研究發菜EPS的抗炎鎮痛活性，結果表明相較于無鹽脅迫發菜胞外多糖，鹽脅迫發菜胞外多糖具有更好的體外抗氧化與抗炎鎮痛活性。為發菜EPS進一步作為功能性食品和多糖藥品等高附加值產品的加工開發提供了數據支持和理論依據。