不同主產國別椰子水成分及預處理方式對細菌纖維素合成的影響

羅佳茜，傅美娟，趙 波，吳毓煒，王哲魁，鄧 健，李從發，劉四新,,*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 ?？?570228；2.海南椰樹集團有限公司，海南 海口 570103；3.海南省產品質量監督檢驗所，海南 ?？?570203；4.海南大學理學院，海南 ?？?570228）

椰子水是細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）生產中最常用且商業利用最成功的原料。BC是一種微生物合成的高聚多糖，因其具有獨特的高純度、高韌性強度、高持水性、生物相容性[1-2]等優良特性而成為國內外的研究熱點，其應用領域廣泛，尤其是在醫藥領域。BC在中國主要作為食品配料，商品名為椰子果。但BC生產效率低、價格昂貴、原料品質受產地環境限制等問題制約了其應用的廣度和深度。一些以提高BC產量為目的的研究主要集中在選育優良的BC生產菌種、優化培養條件和發酵方式等方面，同時也有學者在不斷尋找和挖掘價格低廉但BC產量高的原料培養基，包括水果和蔬菜下腳料[3]、廢料甘油[4]、糖蜜[5]或乳清[6]、農產品[7]及其殘渣[8]、工業副產物[9]等。Kurosumi等[10]以新鮮桔子、蘋果、葡萄等為原料發酵生產BC，產量為0.3～1.8 g/L。楊光等[11]以腐爛水果液為單一營養源合成BC，產量為0.53～2.23 g/L，而以葡萄糖為單一營養源時則不產生BC。腐爛水果液中富含除糖以外的維生素、氨基酸、微量元素等多種營養成分，某些成分可能對BC合成起到重要作用。這些研究的BC產量較低，原料需要經過取汁或除雜等多次處理，不利于投產。椰子水作為椰子的液體胚乳，不僅天然液態、無需榨汁、取用便捷，還是固體胚乳——椰子肉利用工業中的廢棄物，因剩余椰子水極易發酵變質，故作為工業廢物其價格低廉，因此是我國和東南亞國家工業化生產BC最常用和應用最成功的原料。本團隊在同類研究中首次報道椰子水經過自然放置發酵后生產BC，其產量更高且品質更好。王艷梅等[12]提出椰子水在加工廠區預發酵1 d即可使BC產量增加，為新鮮椰子水的25 倍，達到14.5 g/L。Gayathry等[13]比較了Hestrin Schramn（HS）培養基和改良的椰子水培養基用于生產BC的差異，表明改良椰子水培養基中BC的生物合成產率更高，但改良操作并非涉及對其進行“發酵處理”。對于針對性地將椰子水進行預發酵處理后再用于BC發酵生產的研究鮮見其他報道，僅同團隊楊一沖[14]、Zhang Jiachao[15]、鄧健[16]等有過相關報道。

然而，同樣以椰子水為原料，不同國家、地區所產椰子水經過預發酵后進行BC生產的效率和產量仍然差異較大[12]，如從我國和東南亞國家生產BC的工廠實際情況看，東南亞國家的產品效率高、品質好，而海南地區生產BC常存在產量不穩定、產率偏低、BC膜有時軟塌（實際是BC干質量率偏低）等問題，這可能是不同國別地區的氣候條件、生長環境和椰子品種的不同，導致椰子水的化學成分也不盡相同，而椰子水原料成分的差異有可能是引起BC合成效率差異的主要原因之一。為此，本研究選取東南亞代表性的椰子出產國、椰纖果主產國（越南現為中國最大的椰纖果進口國，印度尼西亞（以下簡稱印尼）為中國最大的椰子進口國）和海南的椰子取水進行成分研究，并同時進行“預發酵”的處理，然后比較其對BC合成影響的差異，為椰子水應用于BC生產必須進行“預發酵”處理的觀點提供進一步完善的理論依據，并為進一步解析預發酵過程在菌相變化方面的規律、以代謝組學研究揭示調控BC合成的關鍵化合物等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

Y 1 9：椰凍駒形氏桿菌（Komagataeibacternataicola），為本實驗室分離保藏[17]；YU：駒形氏桿菌（Komagataeibactersp.），為越南檳椥地區BC工廠的生產菌種。

海南椰果采購于本地市場；越南和印尼椰果采購于海南椰樹集團有限公司。海南新鮮椰子水（HNC）、越南新鮮椰子水（YNC）和印尼新鮮椰子水（INC）：取3 個產地的椰果，破殼過濾取水后分別裝入潔凈貯存桶，-20 ℃凍存備用。

實驗室環境下自然預發酵的海南預發酵椰子水（HFC-L）、越南預發酵椰子水（YFC-L）和印尼預發酵椰子水（IFC-L）：3 種新鮮椰子水在實驗室室溫下自然預發酵，分別取樣裝于儲存瓶，-20 ℃凍存備用。

海南工廠環境預發酵椰子水（HFC-F）、越南工廠環境預發酵椰子水（YFC-F）：海南文昌工廠和越南檳椥工廠的自然預發酵椰子水分別取樣，-20 ℃凍存備用。

蔗糖、氫氧化鈉、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、乙酸、3,5-二硝基水楊酸、硝酸、過氧化氫（均為分析純） 廣州化學試劑公司；AccQ·Tag化學組件包（均為色譜純） 沃特世科技（上海）有限公司；28 種元素儲備液（均為色譜純） 中國標準物質中心。

1.2 儀器與設備

X Series（X7）電感耦合等離子體質譜儀 美國賽默飛世爾公司；1100型液相色譜儀 美國安捷倫公司；Esquire HCT質譜儀 美國布魯克公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Delta320-S pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；G154D自動壓力蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；SPX智能生化培養箱 寧波江南儀器廠。

1.3 方法

預處理是使新鮮椰子水直接暴露在自然環境下發酵（分為工廠環境和實驗室環境）一定時間，分別將不同產地新鮮椰子水、預發酵處理后的椰子水配制成培養基接種BC生產菌株（Y19、YU）發酵生產BC膜，以膜干質量為評價指標比較BC合成效率。

1.3.1 礦物質元素質量濃度測定

3 種新鮮椰子水各取5 m L 于消解罐內，加入3 mL HNO3和2 mL H2O2溶液，于165 ℃的恒溫加熱板上加熱4 h，趕酸0.5 h后轉入25 mL容量瓶中定容待測。用電感耦合等離子體質譜儀分析測定[18-19]，質譜儀所用分析標準溶液為國家標準樣品GSB 04-1767-2004 Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn混合標準溶液，Na、K、Ca、Se元素標準儲備液[20-21]。

1.3.2 氨基酸含量測定

采用AccQ·Tag柱前衍生反相-高效液相色譜法[22-23]測定椰子水的氨基酸組分。使用AccQ·Tag化學組件包，包括AccQ·Fluor試劑盒、氨基酸水解標樣（17 種水解氨基酸）。紫外檢測器定量檢測椰子水衍生產物。色譜條件如下：色譜柱為TC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：37 ℃；進樣體積10 μL；洗脫液A為AccQ·Tag洗脫液A用超純水11 倍稀釋而成，洗脫液B為60%色譜純乙腈。梯度洗脫按如下程序進行：洗脫液B初始比例為0%，在0.5 min內升至1%，在16.5 min內升至7%，4 min升至10%，9 min再升至33%，1 min升至100%，保持3 min，最后于1 min內降到0%，并維持12 min；洗脫時間為50 min。

1.3.3 還原糖和總糖質量分數測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定椰子水中還原糖和總糖質量分數[24-25]。

1.3.4 pH值和總酸質量濃度測定

采用pH計法測定pH值；采用滴定法測定總酸質量濃度[26]。

1.3.5 培養基的制備

Y 1 9/Y U 種子液培養基：(N H4)2S O43 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、KH2PO40.3 g/L、預發酵7 d的椰子水70%（體積分數，后同）、蒸餾水30%，pH 5.0，調糖度至6 °Brix，121 ℃滅菌15 min。

B C 發 酵 培 養 基： ( N H4)2S O43 g / L 、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、KH2PO40.3 g/L、新鮮/預發酵1～7 d的椰子水50%、蒸餾水50%，pH 5.0，調糖度至6 °Brix，121 ℃滅菌15 min。

1.3.6 BC的發酵及膜干質量測定

以2%的接種量將種子液接種至BC發酵培養基，30 ℃靜置培養7 d，收獲BC膜。

收獲的BC膜浸泡在0.1 mol/L NaOH溶液中，80 ℃水浴至膜呈乳白半透明狀后取出，0.5%乙酸溶液中浸泡中和，用蒸餾水沖洗BC膜至中性。最后于80 ℃烘箱脫水至恒質量，稱其干質量，按下式計算BC產量。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2013軟件和GraphPad Prism 6軟件進行數據處理和作圖，并使用SPSS 21.0軟件中Duncan’s多重比較法進行顯著性差異分析。實驗結果以平均值±標準偏差表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同國別產地新鮮椰子水成分的測定結果

質譜儀測定結果顯示HNC和YNC中均檢出19 種礦物質，而INC檢出18 種（表1）。3 種椰子水中質量濃度均較高且具有顯著性差異的常量元素有K、Ca、Na、Mg（圖1），HNC的K元素質量濃度顯著高于YNC和INC；INC中Na和Mg含量顯著高于HNC（P＜0.05）。YNC中微量元素Fe、Mn以及重金屬元素Ni、Cd、Cu等質量濃度均較高。3 種椰子水礦物質質量濃度的差異可能受土壤、氣候及椰子品系等的影響較大。

表 1 3 種椰子水礦物質質量濃度Table 1 Mineral contents of three freshcoconut waters

圖 1 3 種椰子水主要常量元素質量濃度比較Fig. 1 Comparison of the contents of major macro elements in three fresh coconut water

表2為3 種新鮮椰子水氨基酸組成及含量。3 種椰子水均檢出16 種氨基酸，HNC中各類氨基酸含量除絲氨酸和甘氨酸外均顯著高于YNC和INC，其總氨基酸含量分別是YNC和INC的2.7 倍和2 倍，INC各類氨基酸含量均高于YNC（天冬氨酸除外）。

3 種椰子水總糖和還原糖質量分數如圖2所示，HNC的總糖質量分數顯著高于YNC和INC（P＜0.05），還原糖質量分數與Y N C 和I N C 相比無顯著性差異（P＞0.05）。3 種椰子水pH值和總酸質量濃度測定結果（表3）顯示H N C 的p H 值最低，其總酸質量濃度（0.482 g/L）顯著高于YNC和INC（P＜0.05）。

表 2 3 種椰子水氨基酸含量Table 2 Amino acid contents of three fresh coconut waters

圖 2 3 種椰子水還原糖和總糖質量分數Fig. 2 Comparison of reducing sugar and total sugar contents in three fresh coconut waters

表 3 3 種椰子水pH值和總酸質量濃度Table 3 pH and total acid concentrations of three fresh coconut waters

成分的測定結果顯示不同國別椰子水的化學成分如礦物質、氨基酸、總糖、總酸水平均具有顯著性差異，HNC的氨基酸、常量元素、總糖和總酸含量豐富，顯著高于YNC（P＜0.05），INC的氨基酸和總酸含量高于YNC。因此，HNC在供給微生物生長所需的氮源、生長因子種類等方面的能力最強，YNC相對較差。

2.2 不同BC菌種對原料椰子水的適應性及合成BC產量的差異

為考察不同國別使用的菌種對發酵原料的適應性和穩定性情況，將越南工廠的BC生產菌種YU和實驗室菌種Y19分別接種至預發酵1～7 d的HNC中（以未發酵的新鮮椰子水為對照），如圖3所示，以新鮮椰子水合成BC時，接種不同菌種獲得的BC產量沒有顯著性差異，但預發酵不同時間后的椰子水接種不同菌種其合成的BC產量差異程度各異。菌種YU發酵生產BC最高產量可達5 g/L左右，但是BC產量波動極大。雖然菌種Y19最高產量明顯低于菌種YU，但菌種Y19 BC產量比較穩定且在預發酵時間內未見明顯減少。說明菌種與原料之間呈現匹配性和相關性，且未發酵過的新鮮椰子水無論是接種實驗室純種還是生產菌種來生產BC都可能不適于投產，這側面說明預發酵的必要性和重要性。

圖 3 不同菌種對不同預發酵時間椰子水合成BC的適應性Fig. 3 Applicability of different strains to BC biosynthesis from coconut water with different pre-fermentation times

2.3 不同國別產地新鮮椰子水對BC產量的影響

為確切比較不同產地新鮮椰子水對BC合成的影響，以3 種新鮮椰子水為原料接種實驗室純種Y19進行實驗。如圖4所示，BC產量均較低，不足1 g/L，且呈現顯著差異（P＜0.05），這與原料成分測定結果的差異性呈正相關關系，HNC的BC產量（0.95 g/L）最高，分別是INC和YNC的2 倍和3 倍，可能正是HNC相較于其他兩種椰子水有更高含量的氨基酸、常量無機元素、有機酸類的化學成分，從而更加促進微生物的生長和BC的合成代謝[27-28]。氨基酸作為生長因子容易透過生物膜被微生物直接吸收，從而促進微生物生長、參與或調節代謝反應等[29]。Matsuoka等[30]表明甲硫氨酸可以縮短BC合成的延遲期、加速細胞生長從而提高產量。YNC的氨基酸含量最低可能是BC產量低的原因之一。新鮮椰子水在不添加任何增效因子時成分的差異可能導致BC產量差異在2～3 倍左右。

圖 4 3 種新鮮椰子水BC產量Fig. 4 BC yield of three fresh coconut waters

2.4 不同預發酵處理方式對BC產量的影響

為了探討椰子水經歷預發酵后是否還能與成分差異呈現某種關聯，故選取化學成分差異最大的HNC和YNC進行預發酵處理，以比較不同預發酵處理方式和原料本身化學成分對BC合成的影響。

2.4.1 不同預發酵環境對BC產量的影響

以工廠和實驗室環境預發酵6 d的椰子水為樣品，對比不同環境預發酵處理后的椰子水對BC合成的促進作用（圖5）。原本BC產量較低的YNC經越南工廠環境預發酵處理后，YFC-F發酵生產BC的產量達到17.6 g/L，是YNC的52 倍，是HFC-F的3 倍左右，而HFC-F產量相比于HNC提高了5 倍。這說明新鮮椰子水的BC合成產量隨著原料預發酵處理后發生了極大改變，新鮮椰子水化學成分差異對BC產量的影響遠不及椰子水預發酵處理對BC產量的影響。同時，YFC-F的產量是YFC-L的32 倍，HFC-F的產量是HFC-L的2 倍，表明工廠和實驗室兩種環境下預發酵的椰子水生產BC的產量存在顯著差異（P＜0.05）。

圖 5 不同預發酵環境對BC產量的影響Fig. 5 Effects of different pre-fermentation environments on BC yield

2.4.2 不同預發酵時間對BC產量的影響

研究不同預發酵時間處理對椰子水發酵生產BC的影響，對實驗室預發酵的椰子水接種實驗室純種Y19（圖6A），對工廠預發酵椰子水接種工廠生產用菌種YU（圖6B）。圖6A中，3 種椰子水的BC產量差異基本與新鮮椰子水化學成分差異相對應、YFC-L的產量始終最低；而圖6B卻顯示YFC-F的BC產量最高，達10 g/L以上，說明不同環境的預發酵效果差異顯著。這可能與工廠環境的微生物區系復雜，發酵后影響椰子水成分的變化，從而覆蓋了原料成分的差異性影響有關，在此過程中，椰子水原料本身化學成分差異在影響BC產量方面可以忽略不計。

從不同預發酵時間點來看，不同預發酵環境（實驗室和工廠）和不同BC合成菌種（Y19和YU）發酵生產BC均呈現類似規律，即預發酵前期（1～3 d）產量不同程度上升，中期相對穩定，6～7 d后基本呈現下降趨勢，可能與椰子水中微生物多樣性、菌群結構的變化密切相關。王艷梅等[12]在研究國內不同產地（海南、云南）椰子水的預處理時間影響時也發現類似變化規律；王志國等[31]比較了以預發酵10～40 d的椰子水為原料生產BC的產量的變化，發現椰子水預發酵時間超過20 d的BC產量下降了24%～50%。說明不同預發酵時間處理對合成BC的影響也較大，但波動幅度不會超過43%。

圖 6 不同預發酵時間對BC產量的影響Fig. 6 Effect of different pre-fermentation time on BC yield

3 結 論

本研究基于不同產地原料化學成分的差異性對椰子水進行不同方式的預發酵處理，比較原料成分和不同預發酵處理方式對BC合成的影響。結果表明：HNC的相關常量元素、氨基酸、糖類和酸類物質含量最高，YNC相關化學成分含量最低；3 種新鮮椰子水的BC產量均很低但差異顯著（P＜0.05），HNC最高、YNC最低，呈現與椰子水本身成分差異的正相關關系。對椰子水進行預發酵不同時間處理后發現YFC-F生產BC的產量顯著高于HFC-F，說明不同環境預發酵處理對BC增產的影響顯著高于原料椰子水化學成分差異造成的影響，在經歷預發酵過程后，椰子水天然成分差異不再是造成BC產量差異顯著的主要因素。從預發酵時間比較發現BC產量呈現前期（1～3 d）上升、中期相對穩定，至后期（6～7 d）又下降的變化規律。這說明椰子水預發酵處理過程中所發生的生物學變化過程研究具有重要意義。新鮮椰子水本身成分顯著影響其生產BC的產量，但是此規律被預發酵過程顯著改變，椰子水的預發酵過程才是影響BC合成效率的最重要的影響環節。未來將明確可以高產BC的預發酵椰子水對應的預發酵時間點，將該時間點下處理的椰子水進行菌相動態變化的深入分析、并進一步研究探討高效促進BC合成的關鍵性小分子代謝物，為深入闡釋BC的合成調控機制提供依據。