輝光放電等離子體對硫色鐮刀菌的殺菌作用

杜明遠，龍海濤，田立鵬，付國瑞，畢 陽，蒲陸梅,*

（1.甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070）

鐮刀菌（Fusarium）是農作物中一種重要的植物病原真菌[1]。該菌種類繁多、分布范圍廣，通過寄生或腐生生活，易侵染多種糧食、油料等農作物，引起根腐、莖腐和穗（粒）腐等多種病害，這些病害嚴重影響了農作物的正常生長及糧食產量，其中以鐮刀菌引起的馬鈴薯干腐病較為常見[2-3]。據報道，中國每年至少有20%的馬鈴薯因采后病害等原因而爛損，而鐮刀菌引起的馬鈴薯干腐病占貯藏期間真菌性病害的50%以上[4-5]。硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）是引起我國西北地區馬鈴薯干腐病的主要病原菌之一，并且致病力最強[6-7]。此外，被硫色鐮刀菌侵染的馬鈴薯塊莖體內會積累大量單端孢霉烯族毒素[8]，其中以T-2毒素的毒性最強[9]，這類毒素不僅降低了馬鈴薯的品質，而且還會通過不同的毒性機制對人和動物產生毒性，給人和動物的食用安全帶來嚴重隱患。因此，有效控制和殺滅鐮刀菌在馬鈴薯病害防控領域具有重大意義。

目前，國內外多采用化學防治、生物防治措施對馬鈴薯干腐病進行預防和控制[10]。較為常用的化學殺菌劑能夠有效地控制馬鈴薯干腐病，但是大多數化學殺菌劑處理會對環境造成污染，農藥殘留問題嚴重，而且還會使病原體產生抗藥性[11]。生物防治是指通過對鐮刀菌具有拮抗作用的菌種（主要有木霉屬真菌、非致病尖孢鐮刀菌和芽孢桿菌）抑制鐮刀菌的生長，從而控制干腐病的發生。然而，微生物之間這種生長抑制作用易受溫度、濕度等各種環境因素的影響，并且大多數拮抗菌多為實驗室篩選，在自然環境下繁殖能力較弱，對鐮刀菌生長抑制作用有限，這些因素制約了該技術在生產實踐中廣泛應用[12]。因此，尋找一種能代替化學和生物殺菌劑且安全高效、不受環境條件制約、對環境無污染的方法成為關鍵。

輝光放電等離子體（glow discharge plasma，GDP）作為一種新型的高級氧化技術，是一種能夠在水溶液中通過直流放電產生等離子體的電化學方法[13-14]。其原理是利用外加直流電場作用，在特定的電化學反應容器內，當兩極間的電壓（500～600 V）足夠高時，電極與周圍電解液之間會持續產生如·OH、·H、H2O2等多種高活性粒子[15]。研究表明，在輝光放電過程中，這些活性粒子就是輻射源，能夠影響后續的反應，在電解質溶液中參與化學反應并提供活性中間體[16-17]。有大量文獻報道該方法已成功應用于污水處理和有機染料降解[18-21]。另外，還有相關文獻報道表明，GDP處理能夠高效去除食物中真菌毒素（棒曲霉素、T-2毒素和立枯絲核菌毒素），并且對食物的品質和營養成分影響很小[22-25]；此外，該方法具有操作簡單、反應條件溫和（常溫、常壓）、環保無殘留物等優點，但是該技術在食物中病原真菌殺滅方面鮮有文獻報道。因此，本實驗選擇硫色鐮刀菌為研究對象，研究GDP對硫色鐮刀菌孢子的殺滅效果，同時從細胞生物學角度初步考察對該菌的殺菌機理，旨在為GDP技術應用于殺滅食物中鐮刀菌提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）BNCC 117681由甘肅農業大學食品科學與工程學院微生物實驗室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基自制；馬丁氏瓊脂培養基的制備參考文獻[26]。

葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨 上海中秦化學試劑有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD生物潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；DHP-9272B恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；CX21 FS1C生物顯微鏡、BX53熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；DH1722-6高壓直流電源北京大華無線電儀器廠。

GDP殺菌設備（圖1）主要包括反應器和高壓直流電源兩個部分。其中反應器由兩根電極組成，陽極是由直徑為0.5 mm的鉑絲組成，陰極是由直徑為1.0 cm的碳棒組成。外部設備冷卻水裝置控制反應溫度，磁力攪拌器促使等離子體中活性成分與電解質溶液充分反應。

圖 1 GDP反應系統示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the GDP experimental apparatus

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

參考潘春青等[27]的方法，將1 mL無菌水滴加至含硫色鐮刀菌菌株的斜面培養物中，搖勻，吸取200 μL菌懸液滴加至PDA培養基中心位置，用玻璃棒涂布均勻，26 ℃ 恒溫培養5 d后，篩選出生長良好的菌株，用直徑為6 mm的打孔器在PDA培養基上打取菌餅，用鑷子挑取并接種于新制PDA培養基，26 ℃恒溫培養7 d后，4 ℃ 冰箱保存，備用。

1.3.2 孢子懸浮液的制備

參考胡林剛等[5]的方法，取26 ℃培養7 d的硫色鐮刀菌培養皿1 個，加入10 mL無菌水，用玻璃涂布棒刮下平板上的硫色鐮刀菌孢子，經雙層紗布過濾然后轉入150 mL錐形瓶中，充分振蕩后，移取10 μL濾液滴加到血球計數板計數，顯微鏡觀察計數，用無菌水稀釋至所需濃度為2×106個/mL。

1.3.3 GDP處理

取50 mL濃度為2.0×106個/mL的孢子懸浮液，將其加入到輝光放電反應容器中，通過調節電源電壓從0逐漸增加到650 V，測定電流強度隨電壓的變化曲線。根據GDP的特性，確定等離子體產生的條件（電壓及電流強度變化范圍）在確定的電壓及電流強度變化范圍內，并在室溫、常壓條件下對孢子懸浮液進行輝光放電處理。

1.3.4 單因素試驗

選取處理電壓分別為500、520、540、580、600 V，處理時間分別為3、6、9、12、15、18 min，電極極距分別為1.0、1.5、2.0、2.5 cm，以Na2SO4、NaNO3、NaCl、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液作為電解質，研究GDP處理電壓、時間、極距和電解質對硫色鐮刀菌殺菌率的影響。

1.3.5 響應面法優化GDP對殺菌效果的影響

參考張志偉[28]的方法，在單因素試驗的基礎上，設計Box-Behnken實驗方案以處理電壓（A）、處理時間（B）和電極極距（C）作為響應變量，以殺菌率（Y）作為響應值，設計響應面分析試驗，試驗因素和水平見表1。

表 1 響應面設計因素-水平表Table 1 Code and level of independent variable used for response surface design

1.3.6 殺菌率測定

通過硫色鐮刀菌殺菌率分析各因素對GDP殺菌效果的影響，參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》測定100 μL孢子懸浮液中的孢子存活數量。殺菌率根據下式計算。

式中：N0為GDP處理前硫色鐮刀菌菌落數/CFU；N為GDP處理后硫色鐮刀菌菌落數/CFU。

1.3.7 驗證實驗

取50 mL濃度為2.0×106個/mL的孢子懸浮液加入到輝光放電反應容器中，在優化后的最佳GDP工藝條件下處理孢子懸浮液，移取0.5 mL加入到含有4.5 mL無菌水的玻璃試管后，振蕩混勻，隨后進行10 倍梯度稀釋，選擇稀釋度為103，將孢子懸浮液涂布于馬丁氏瓊脂培養基，26 ℃培養48 h后進行菌落計數，以未經GDP處理的孢子懸浮液作為對照組進行菌落計數。

1.3.8 生理活性指標測定

取50 mL濃度為2.0×106個/mL的孢子懸浮液加入到輝光放電反應容器中，在優化后的最佳GDP工藝條件下處理孢子懸浮液，測定以下硫色鐮刀菌孢子指標，其中以未經GDP處理孢子作為對照。孢子萌發率：參考胡林剛等[5]的方法，通過生物顯微鏡觀察統計孢子萌發數；菌絲生長量：參考燕璐[29]的方法，通過十字交叉法測定菌落直徑和菌體干質量；細胞膜滲透性：參考周靈靈等[30]的方法測定孢子懸浮液的相對電導率；孢子孢內物質釋放量：參考蓋智星等[31]的方法，通過紫外吸收法測定孢子孢內可溶性蛋白和核酸滲漏量；麥角甾醇質量濃度：參考蘆慧[32]的方法通過紫外吸收法測定；丙二醛濃度：參考蘆慧[32]的方法采用硫代巴比妥酸比色法測定；孢子碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色：參考燕璐[29]的方法通過熒光顯微鏡觀察孢子細胞膜完整性。

1.4 數據處理與分析

每組實驗均設3 個平行，用Excel 2016軟件進行數據計算，用Origin 9.0軟件繪圖，用Design-Expert 8.06軟件進行響應面設計并對數據進行方差分析，用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行多重比較，分析顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 GDP電流強度-電壓特征曲線

以硫色鐮刀菌孢子懸浮液作為電解液的GDP電流強度-電壓特征曲線如圖2所示，電流強度隨電壓的變化可以分為4 個階段：在AB段，電壓處于0～150 V，電流強度隨電壓的增加而增加，其變化遵循歐姆定律，屬于普通的電解水的過程；在BC段，電壓處于150～400 V，電流強度隨電壓的增加而減小，這一現象的產生是由于隨電壓的增大，在陽極尖端的電流熱效應導致陽極附近電解液有一定程度的汽化現象，產生了絕緣性的氣泡，并且絕緣性氣泡的產生量隨著電壓的增加而增加；在CD段，電壓處于400～520 V，電流強度隨電壓的增加而出現不穩定的上下波動，這一現象的產生是隨著電壓進一步增大，在陰極發射出的電子在電場中加速成為高能電子，高能電子與陽極尖端氣態水分子發生碰撞，激發氣態水分子發生了部分電離所致，并且在該階段陽極尖端出現了微弱的淡紫色輝光；在DE段，電壓處于520～650 V，電流強度隨著電壓的增加而增加，陽極尖端氣泡與高能電子的碰撞加劇，從而促進了氣態水分子的進一步電離，并且電離程度隨著電壓的增加而增大，這一階段也是產生等離子體的主要階段，調節電壓至540 V，陽極尖端能夠觀察到非常明顯的紫色輝光且比較穩定，因此選擇540 V電壓作為殺菌電壓，此時電流強度變化范圍是40～50 mA。

圖 2 硫色鐮刀菌孢子懸浮液的GDP電流強度-電壓特征曲線Fig. 2 Characteristic curve of current against voltage of F. sulphureum spore suspension

2.2 GDP產生條件對硫色鐮刀菌孢子的殺菌作用

2.2.1 電壓對殺菌率的影響

圖 3 電壓對硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 3 Effect of voltage on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖3可以看出，控制孢子懸液濃度為2.0×106個/mL，在處理時間為9 min、電極極距為2 cm的條件下，隨著電壓從500 V升高到600 V，GDP對硫色鐮刀菌孢子的殺菌效果逐漸增強，600 V時殺菌率為95.93%，而在500 V時殺菌率僅為20.85%，產生這種現象的原因可能是當電壓較低時，在陰極發射的電子在電場中加速獲取的能量較低，從而與陽極尖端氣態水分子發生碰撞，激發氣態水分子發生電離產生的活性粒子（·OH、·H、H2O2）[15]較少，最終導致了等離子體的殺菌效果很弱[33]。張錚等[34]研究介質阻擋放電等離子體對葡萄球菌殺滅效果中也指出，提高電極間電場強度可以增強殺菌效果，與本實驗結論一致。

2.2.2 處理時間對殺菌率的影響

圖 4 處理時間對硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 4 Effect of treatment time on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖4可以看出，控制孢子液濃度2.0×106個/mL、處理電壓540 V、電極極距2 cm的條件下，GDP對硫色鐮刀菌孢子的殺滅作用隨著處理時間的延長而增大，當處理18 min后，其殺菌率為85.99%，而處理3 min時，殺菌率僅為18.21%，這與Misra等[35]研究發現通過介質阻擋放電激發產生的等離子體，其殺菌效果隨著處理時間的延長先上升后趨于平緩基本一致。

2.2.3 電極極距對殺菌率的影響

圖 5 電極極距對硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 5 Effect of inter-electrode distance on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖5可以看出，控制孢子液濃度2.0×106個/mL、處理電壓540 V、處理時間9 min的條件下，GDP處理對硫色鐮刀菌孢子殺滅作用隨著電極極距的增加而減小。當電極極距從1.0 cm增加到3.5 cm時，其殺菌率從55.92%減小到9.53%。產生這種現象的原因可能是由于電極極距的增加引起電極兩端的電場強度減小，導致陰極發射的電子在電場中加速獲取的能量減少，最終導致電子與氣態水分子碰撞激發產生的活性粒子減小，所以殺菌率隨著電極極距的增加而減小。張錚等[34]在研究介質阻擋放電等離子體殺菌效果時指出，電極極距對殺菌率的影響是通過改變電極間電場強度實現的。

2.2.4 電解質對殺菌率的影響

圖 6 電解質對硫色鐮刀菌孢子殺菌率的影響Fig. 6 Effect of electrolytic solutions on the fungicidal efficiency of F. sulphureum spores

由圖6可以看出，控制孢子液濃度2.0×106個/mL、處理電壓540 V、處理時間9 min、電極極距2 cm的條件下，在4 種不同的電解質溶液中，GDP處理對硫色鐮刀菌孢子也具有明顯的致死作用。其中在NaCl電解質溶液中GDP的殺菌率最高，達90.14%，這是由于NaCl在放電過程中會生成HClO，而HClO是一種強氧化性物質，具有一定的殺菌作用。夏青[36]在研究NaCl和Na2SO4兩種電解質中GDP殺菌效果時，也得出同樣的結論。

2.3 響應面試驗設計結果

2.3.1 回歸方程及方差分析結果

將響應面試驗結果（表2）經Design-Expert軟件對數據進行回歸分析擬合，得到電壓、處理時間和電極極距之間的多元二次回歸方程：Y＝77.09+12.31A+9.76B-4.28C+10.94AB+3.19AC+2.43BC-8.05A2-9.15B2-6.14C2。

表 2 響應面試驗設計及其結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

由表3可知，回歸模型顯著，失擬項不顯著，模型的決定系數R2為0.992 7，校正決定系數為0.983 2，說明該方程擬合較好，能有效反映GDP殺菌效果與電壓、處理時間和電極極距間的關系。一次項A、B、C，交互項AB，二次項A2、B2、C2影響極顯著，因此電壓、處理時間和電極極距對殺菌率的影響不是一般的線性關系。根據F值可知，各因素對殺菌率的影響由強到弱依次是A（電壓）＞B（處理時間）＞C（電極極距）。

表 3 響應面試驗設計結果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

2.3.2 響應面試驗結果分析及驗證實驗

2.3.2.1 電壓與處理時間交互作用對殺菌率的影響

圖 7 電壓與時間交互影響殺菌效果的響應面（A）和等高線圖（B）Fig. 7 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between voltage and time on fungicidal efficiency

由圖7A可知，響應面坡度較陡，表明電壓和處理時間的交互作用顯著。由等高線圖（圖7B）可知，當電壓一定時，殺菌效果隨著處理時間的延長而逐漸增強；當處理時間一定時，殺菌效果隨著電壓的增大而逐漸增強。

2.3.2.2 電壓與電極極距交互作用對殺菌率的影響

圖 8 電壓與電極極距交互影響殺菌效果的響應面（A）和等高線圖（B）Fig. 8 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between voltage and inter-electrode distance on fungicidal efficiency

由圖8A可知，響應曲面彎曲程度較小，說明處理電壓與電極極距交互作用不明顯。等高線圖（圖8B）反映了當處理電壓一定時，殺菌率隨著處理極距的增大而減小。

2.3.2.3 處理時間與電極極距交互作用對殺菌率的影響

圖 9 處理時間與電極極距交互影響殺菌效果的響應面（A）和等高線圖（B）Fig. 9 Response surface (A) and contour (B) plots showing the effect of interaction between time and inter-electrode distance on fungicidal efficiency

由圖9A可知，響應曲面趨于平緩，說明時間與電極極距交互作用不明顯。等高線圖（圖9B）反映了當處理時間一定時，殺菌率隨著處理電極極距的增加而減??；當電極極距一定時，殺菌率隨著處理時間的延長而增大。

2.3.2.4 驗證實驗結果

對多元二次回歸方程經數學分析，得到殺菌率的最大值。確定最優實驗條件為電壓560 V、時間15 min、電極極距1.55 cm時，理論殺菌率可達92.97%。綜合單因素試驗及響應面試驗結果，將最佳殺菌條件調整為處理電壓560 V、處理時間15 min、電極極距1.5 cm。通過驗證實驗結果，重復3 次最優條件取平均值，得出硫色鐮刀菌殺菌率為92.73%，與預測值相差0.24%，處理前后菌落變化比較見圖10。

圖 10 對照組（A）和處理組（B）菌落比較圖Fig. 10 Comparison of colonies between control (A) and treatment (B) groups

2.4 GDP對硫色鐮刀菌孢子生理活性的影響

2.4.1 GDP對硫色鐮刀菌孢子生長的影響

表 4 GDP對硫色鐮刀菌孢子生長的影響Table 4 Effect of GDP on spore growth of F. sulphureum

表4反映了GDP對硫色鐮刀菌孢子的生長抑制作用。在最優處理條件下處理后，孢子萌發率、菌落直徑及菌體干質量均顯著降低（P＜0.05），其分別降低82.01%、37.16 mm、96.30 mg，說明GDP對硫色鐮刀菌生長活性的抑制作用顯著。

2.4.2 GDP對硫色鐮刀菌菌體質膜完整性及氧化損傷程度的影響

相對電導率是反映菌體細胞膜滲透性的重要指標之一，相對電導率越高，說明細胞膜滲透性越大[28]。麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組分，對維持真菌細胞結構和膜的完整性以及膜上一些功能蛋白的正常功能發揮重大作用，因此通過麥角甾醇質量濃度的變化可以間接反映GDP處理對細胞膜完整性的影響[37]。丙二醛為細胞膜過氧化分解的產物，因此可將其含量作為反映細胞膜過氧化損傷程度的重要指標[32]。PI為非膜滲透性熒光染料，質膜完整的細胞中，PI無法正常進入，因此只有細胞膜破壞后細胞才能被染料染色，而正常細胞不能染色[29]。

圖 11 PI染色檢測孢子細胞膜完整性Fig. 11 Detection of cell membrane integrity in spores by propidium iodide staining

由表5可知，經GDP處理后，相對電導率增加了21.21%，說明細胞膜的選擇透過性發生了改變[28]；通過測定胞內可溶性蛋白和核酸滲漏量，發現GDP處理后細胞懸液中兩者質量濃度均顯著增大，說明細胞膜已經發生了損傷或是出現了破裂，導致細胞內容物流出[34,38]。GDP處理后細胞膜麥角甾醇質量濃度減小了16.87 μg/mL，而丙二醛濃度增加了0.291 μmol/L，結合杜亞楠[39]的研究結果，推斷細胞膜很可能是等離子體作用的主要位點，并且與細胞膜上麥角甾醇有密切聯系；丙二醛濃度的增加證明細胞膜發生了脂質過氧化反應。最后將GDP處理后的孢子進行PI染色觀察，結果如圖11所示，可以看出對照組孢子活性良好，沒有被PI染色劑染色，而處理組孢子出現了不同程度的熒光染色，染色后熒光強度反映細胞膜滲透性，染色越深說明細胞膜滲透性越大[29]。

3 討 論

本實驗采用的是一種在液相介質中產生等離子體的方式——輝光放電電解。首先通過單因素試驗，研究不同因素（電壓、處理時間、極距和電解質）對殺菌率的影響；結果發現，電壓、處理時間和極距都是影響GDP殺菌效果的有效因素。增加電壓、延長處理時間以及減小電極極距都可以提高殺菌效果。通過響應面分析方法建立的硫色鐮刀菌殺菌率的二次項數學模型分析得出各因素對殺菌率的影響大小依次是：電壓＞處理時間＞電極極距，在電壓560 V、電極極距1.5 cm、處理時間15 min的條件下，殺菌率達到92.73%，此時輝光放電對硫色鐮刀菌孢子有很好的殺滅效果。

GDP主要包括高活性粒子（·OH、·H、H2O2）、帶電離子、高能電子以及能產生電子躍遷發射射線的激發態原子和分子等[15]。關于其殺菌機理，相關文獻主要從等離子體物理化學效應和細胞生物學兩個方面進行報道。從等離子體物理化學方面來講，殺菌機理包括高活性粒子（·OH、H2O2）的氧化降解作用[15]；在電場中高能電子和離子對微生物菌體的蝕刻作用[38,40]以及紫外線的輻射作用，但是目前關于紫外線的輻射殺菌作用存在爭議[40]。從細胞生物學方面，相關文獻不能有效確定等離子體作用于微生物細胞的具體位點（細胞壁、細胞膜、胞內蛋白質、核酸以及細胞器等都有可能是等離子體的作用位點）[41]。

細胞膜是細胞與外界環境進行物質交換和信息傳遞的保護屏障，其穩定性是細胞進行正常生理功能的基礎[32]。因此，細胞膜是維持細胞活性的重要結構。本研究通過輝光放電處理孢子，發現處理前后等離子體對細胞膜活性的影響非常顯著。結果表明，等離子體作用于細胞膜，膜上發生了脂質過氧化，膜的組成成分麥角甾醇質量濃度顯著減小，膜的滲透性增大，孢內大分子物質蛋白質和核酸跨膜滲漏到胞外。另外，有大量文獻報道關于化學抗菌劑對植物病原真菌的抑菌機理，認為細胞膜是化學抗菌劑作用于植物病原真菌的主要靶點，且與細胞膜上麥角甾醇有密切聯系，通過影響細胞膜的滲透性而影響胞內正常的生理生化反應，從而達到抑菌的效果[5,29,31-32,39]。這與等離子體對細胞膜活性的影響結果也相一致。至于是等離子體中何種成分在起作用，以及采用什么作用機制（氧化作用、蝕刻作用、紫外輻射作用），還需要在后續實驗中進一步證明。

另外，還有相關文獻報道了有機酸、多酚類有機物，如水楊酸、茶多酚等對硫色鐮刀菌產毒能力的影響，結果表明這兩種有機物對硫色鐮刀菌產毒能力的影響均表現出了顯著的濃度效應[42-43]。但是關于GDP技術對硫色鐮刀菌產毒能力的影響，目前還鮮見相關文獻報道，這將在后續實驗中進行研究。