蠶豆多酚對過氧自由基介導的DNA損傷的保護作用

林 琳，盧躍紅，陳友霞，劉珍珍，趙一靈，高春燕

（大理大學公共衛生學院，云南 大理 671000）

蠶豆（Vicia fabaL.）又稱胡豆、佛豆、蘭花豆等，屬豆科一年生草本植物，是我國的重要豆類作物之一[1]。中國是世界上蠶豆種植面積最大的國家[2]，中國的菜用和糧用蠶豆以江蘇、浙江、安徽、四川、湖北和云南等省種植最多[3]。蠶豆是高蛋白、低脂肪、中等淀粉含量的作物，富含維生素和礦物質[4]，其中還含有大量生物活性物質，如原花色素、活性蛋白、異黃酮等，具有抗氧化活性、抗腫瘤、抗過敏、抗炎、抗動脈粥樣硬化等生理功能[5-13]。

DNA是生命活動中的重要遺傳物質，控制細胞的增殖和分化[14]。有學者研究發現，DNA氧化損傷可導致細胞基因突變、癌變以及神經退行性病變[15]。而過氧自由基（ROO·）可以引起DNA氧化損傷，進而引起各種慢性疾病，其中，清除自由基、提高機體抗氧化能力是許多藥物防治慢性疾病的重要途徑[16]。目前研究已發現，許多植物如硬毛地筍[14]、黃杞[15]、紅豆越橘[17]等的多酚提取物對自由基介導的DNA氧化損傷具有顯著的保護作用，但關于蠶豆多酚對ROO·介導的DNA損傷保護作用的研究鮮有報道。我國是世界重要的蠶豆種植大國，其中云南省蠶豆品種資源豐富，通過分析云南省10 種蠶豆種皮和子葉的多酚含量及采用體外2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）引發產生ROO·損傷pBR322質粒DNA模型，研究其多酚提取物對ROO·介導的DNA損傷的保護作用，旨在為云南省蠶豆優良品種選育、指導消費者食用及提高云南省蠶豆經濟價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆由云南省農業科學研究院蠶豆研究室提供，2017年上半年采樣。

Folin-酚試劑 美國Sigma公司；沒食子酸 成都市科龍化工試劑廠；兒茶素 晶博生物科技有限公司；AAPH 美國Thermo Fisher公司；Na2CO3、亞硝酸鈉、AlCl3、NaOH、甲醇、乙酸乙酯、Tris、瓊脂糖均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；JA3003電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；RE-3000旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；恒溫水浴箱 金壇市大地自動化儀器廠；722N可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；G:BOX-F3凝膠成像系統香港基因有限公司；CM-700d分光測色計 日本Konica Minolta公司。

1.3 方法

1.3.1 蠶豆物理參數的測定

參考《蠶豆種植資源描述規范和數據標準》[18]分別測定種皮色和子葉色、粒形、百粒質量。參考田曉紅等[19]的方法分別測定蠶豆種皮質量分數、顏色（明度L*、紅綠度a*、黃藍度b*）和密度。

1.3.2 蠶豆多酚的提取

參考文獻[20]的方法稍作修改，將自然成熟干燥的10 個品種蠶豆手工分離出種皮和子葉，粉碎過60 目篩。分別精密稱取種皮粉末5.0 g、子葉粉末10.0 g，加入10 倍體積的體積分數80%甲醇溶液，室溫下超聲波（59 kHz）輔助提取3 次，每次10 min，抽濾，合并濾液，35 ℃下旋轉蒸發除去甲醇，剩余水相用6 mol/L鹽酸溶液調節pH值（pH 1～2），后用乙酸乙酯萃取5 次，合并乙酸乙酯相，37 ℃旋轉蒸發去除乙酸乙酯，殘留物用少量二甲基亞砜溶解，后用蒸餾水定容至10 mL，得蠶豆多酚提取液。

1.3.3 總酚含量的測定

采用Folin-酚法[21]測定總酚含量，得沒食子酸標準曲線方程為y＝0.073 7x+0.050 6（0～6.4 μg/mL），決定系數R2＝0.997 9。樣品中的總酚含量結果以每克蠶豆中與沒食子酸相當的質量表示（mg/g）。

1.3.4 黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-氯化鋁法[22]測定黃酮含量，得兒茶素標準曲線方程為y＝0.009 6x+0.011 8（0～50 μg/mL），決定系數R2＝1.000 0。樣品中的黃酮含量結果以每克蠶豆中與兒茶素相當的質量表示。

1.3.5 蠶豆多酚對ROO·介導的DNA損傷保護作用的測定

參考Spanou等[23]的方法稍作修改。將蠶豆多酚提取液配制成質量濃度為25 μg/mL的待測液，反應液共20 μL，包括1 μL（0.5 μg/L）pBR322質粒DNA、11 μL（10 mmol/L、pH 7.4）磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、5 μL蠶豆多酚待測液或Trolox（質量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）和3 μL（50 mmol/L）AAPH溶液，充分混勻后置于37 ℃水浴中避光反應45 min。反應結束后吸取4 μL反應液與2 μL loading buffer（含0.15%溴酚藍、10 mmol/L乙二胺四乙酸和40%蔗糖）混合均勻，準確吸取4 μL混合液置于1.0%的瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠）中，并在Tris/乙酸/乙二胺四乙酸緩沖溶液中電泳50 min。待電泳結束后，利用凝膠成像系統進行半定量分析。空白對照使用PBS代替蠶豆多酚待測液，正常對照用PBS代替蠶豆多酚待測液和AAPH溶液，用Trolox作為陽性對照。按下式計算雙螺旋比例。

式中：A1為雙螺旋DNA的灰度；A2為開環型DNA的灰度；A3為線型DNA的灰度。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復3 次，數據用平均值±標準差表示，采用Excel、SPSS 20.0軟件的Tukey HSD法進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 蠶豆物理參數

圖 1 10 種蠶豆的外觀形狀Fig. 1 Appearance of 10 varieties of broad beans

由表1、圖1可知，10 種蠶豆的百粒質量范圍為80.71～149.59 g，其中‘云豆5932’最小，‘云豆147’最大，有兩個品種百粒質量小于100 g，分別為‘云豆3145’（93.54 g）和‘云豆5932’（80.71 g），10 個品種中最大百粒質量與最小百粒質量相差68.88 g，比田曉紅等[19]的研究結果低，表明云豆系列蠶豆質量性狀總體上較相似。10 種蠶豆的皮占總質量的比例范圍為13.26%～16.76%，變化范圍較小，‘云豆5932’的最低，‘云豆459’的最高。10 種蠶豆密度范圍為1.09～1.28 g/cm3，‘云豆459’最小，‘云豆5932’最大。10 種蠶豆的長度范圍為1.31～2.10 cm，寬度范圍為1.05～1.50 cm，高度范圍為0.49～0.73 cm，‘云豆5932’的長度和寬度最小，‘云豆459’的高度最小，‘云豆1299’的長度和寬度均最大，‘云豆5932’的高度最大，‘云豆5932’長寬比較小，粒形為近球形，最有利于機械化生產。

L*值為0時表示物體為對光完全吸收的黑體；L*值為100時表示物體為對光完全反射的純白物體[19]，10 種蠶豆的L*值范圍為36.86～50.69，‘云豆1299’最小，‘云豆5932’最大；10 種蠶豆的a*值范圍為5.19～18.32，均為正值，表現為偏紅色，其中‘云豆112’最小，‘云豆16’最大；10 種蠶豆的b*值范圍為19.98～29.97，均為正值，表現為偏黃色，其中‘云豆1299’最小，‘云豆1862’最大。

2.2 蠶豆多酚提取物總酚和黃酮含量

表 2 10 種蠶豆的總酚和黃酮含量Table 2 Total polyphenol and flavonoid contents of 10 varieties of broad beans

表 1 10 種蠶豆的物理參數Table 1 Physical parameters of 10 varieties of broad beans

由表2可知，種皮中總酚含量范圍為1.13～2.67 mg/g，其中‘云豆1862’含量最低，‘云豆2850’含量最高；子葉中總酚含量范圍為0.08～0.23 mg/g，其中‘云豆112’含量最低，‘云豆1299’含量最高。種皮中黃酮含量范圍為2.99～6.56 mg/g，其中‘云豆1862’含量最低，‘云豆2850’含量最高；子葉中黃酮含量范圍為0.26～1.07 mg/g，其中‘云豆2850’含量最低，‘云豆147’含量最高。

結果表明，蠶豆種皮中的總酚和黃酮含量顯著高于子葉，與Chaieb等[24]的研究結果一致。兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸原花青素二聚體和表兒茶素是整粒蠶豆提取物中的主要酚類物質[25]，而原花青素主要分布于蠶豆種皮中，質量分數最高可達12%[26-28]。劉玉皎[29]研究得出種皮顏色可以作為鑒定原花青素含量高低的標志性狀，顏色越深，原花青素含量越高，蠶豆種皮顏色較子葉深，故蠶豆種皮中總酚和黃酮含量較高。不同品種間蠶豆種皮與子葉中多酚和黃酮含量差異顯著，此結果與楊希娟[30]的研究結果一致，可能與不同品種蠶豆的培育方法、培育時間、培育環境等不同有關。蠶豆種皮和子葉總酚和黃酮含量總和低于趙艷等[31]報道的結果（總酚含量8.05～8.37 mg/g、黃酮含量6.80～7.54 mg/g），結果的差異可能與蠶豆來源、品種及提取測定方法差異有關。

相關性分析結果表明，10 種蠶豆種皮中總酚含量與黃酮含量具有極顯著正相關性（r＝0.814，P＜0.01）；相反，子葉中總酚和黃酮含量呈顯著負相關關系（r＝-0.375，P＜0.05）。表明在種皮中，黃酮是主要的酚類化合物，對總酚的含量具有顯著的貢獻，而在子葉中，黃酮類化合物含量較低，游離酚酸可能是其主要的酚類化合物。

2.3 蠶豆多酚提取物對ROO·介導的DNA損傷的保護作用

圖 2 Trolox和蠶豆多酚提取物對ROO·介導的DNA損傷的保護作用Fig. 2 Protective effect of Trolox and polyphenols from broad beans on DNA damage induced by ROO· radicals

蠶豆多酚提取物對ROO·介導的DNA損傷的保護作用以DNA雙螺旋比例表示，保護作用越強，DNA損傷越少，顯示雙螺旋比例越高。由圖2A1～E1的泳道1可見，正常pBR322質粒DNA以DNA雙螺旋結構為主，被ROO·損傷后（圖2A1～E1泳道2），DNA雙螺旋結構轉變成開環型或者線型結構，當添加蠶豆多酚提取物或人工合成抗氧化劑Trolox后，DNA雙螺旋結構未全部轉變成開環型或線型結構，說明蠶豆多酚提取物和人工合成抗氧化劑Trolox可在一定程度上阻止由ROO·引起的DNA雙鏈的斷裂。

由圖2A1可知，不同質量濃度的Trolox對ROO·介導的DNA損傷均有保護作用，在6.25～50 μg/mL范圍內，DNA雙螺旋比例范圍為86.15%～91.80%，保護作用隨著質量濃度的增加而增加，但當質量濃度增加到50 μg/mL以上時，不同質量濃度Trolox對DNA損傷的保護作用差異無統計學意義（P＞0.05）。

對于蠶豆種皮來說，在25 μg/mL Trolox下，DNA雙螺旋比例范圍為86.38%～93.91%（圖2B2和C2），其中‘云豆147’的保護作用最弱，‘云豆3145’的保護作用最強，且‘云豆3145’、‘云豆5932’可使正常pBR322質粒DNA基本不受損傷，與正常組的DNA雙螺旋比例無顯著性差異（P＞0.05），蠶豆種皮多酚提取物的保護作用效果均較好，與100 μg/mL的Trolox的保護作用相似；對于蠶豆子葉來說，在25 μg/mL質量濃度下，DNA雙螺旋比例范圍為39.13%～71.90%（圖2D2和E2），其中‘云豆147’的保護作用最弱，‘云豆16’的保護作用最強。

酚類化合物抗氧化機理主要是通過酚羥基遞氫反應來清除AAPH引發產生的ROO·，起到抗氧化的作用，酚羥基周圍的取代基對酚羥基的遞氫能力有重要影響[32]，所以酚類化合物自身的結構影響酚類化合物的DNA損傷保護作用。結果顯示，同一多酚質量濃度，不同品種間DNA損傷保護作用具有差異，且同一品種種皮的保護作用強于子葉。因此，不同品種、不同部位蠶豆多酚提取物對ROO·介導的DNA損傷保護作用的差異，可歸因于不同部位以及不同品種的蠶豆多酚提取物中所含的單體不同。此外，結果表明，種皮顏色深的蠶豆品種對DNA損傷的保護作用較好，這與Marathe等[33]的研究結果一致，表明蠶豆種皮多酚提取物具有較好的DNA氧化損傷保護活性。然而蠶豆種皮因其過硬的口感常被人們所丟棄，若能將蠶豆種皮進行開發利用，將對預防慢性疾病大有裨益。

3 結 論

不同品種的蠶豆物理參數不同；蠶豆種皮和子葉中總酚含量范圍分別為1.30～2.67、0.08～0.23 mg/g，黃酮含量范圍分別為2.99～6.56、0.26～1.07 mg/g，種皮高于子葉，且不同品種總酚和黃酮含量具有差異；種皮和子葉多酚提取物對ROO·介導的DNA損傷雙螺旋比例范圍分別為86.38%～93.91%和39.13%～71.90%，種皮的保護作用顯著強于子葉。結果表明，蠶豆酚含量豐富，具有顯著的DNA氧化損傷保護作用，可作為抗氧化食品食用，且在食用過程中，不應將種皮丟棄。另外，在種植加工過程中，應根據生產需要選擇適宜的蠶豆品種。