烷過氧自由基氧化對草魚肌原纖維蛋白熱聚集行為的影響

李學鵬，劉慈坤，王金廂，周明言，藺博燕，李文協，朱文慧，勵建榮，林 洪

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，國家魚糜及魚糜制品加工技術研發分中心，遼寧 錦州 121013）

草魚又名鯇魚，屬鯉形目、鯉科、草魚屬，是我國重要淡水經濟魚類之一。2018年我國草魚養殖產量達550.43萬 t，在全國淡水養殖主要魚類中排第一位[1]。草魚營養價值高，是一種高蛋白、低脂肪的健康食品，含有豐富的VB1、VB2、煙酸、不飽和脂肪酸，以及鈣、磷、鐵、鋅、硒等微量元素[2]。此外草魚肉質鮮美且價格低廉，深受廣大消費者的喜愛。然而，草魚肌肉含水量高、肉質嫩、易腐敗變質。另外，因含有豐富的多不飽和脂肪酸，在脂肪氧合酶的作用下易發生脂質過氧化反應，導致草魚在貯藏加工過程中易氧化酸敗[3-4]。

脂質過氧化反應較為復雜，其中活性物質主要包括脂質自由基和活性脂質氧化產物，這些活性物質具有氧化蛋白質的能力，可導致蛋白質結構及功能性質的變化[5-7]。已有研究表明，烷過氧自由基是脂質過氧化反應中最主要的自由基中間體，在誘導水產品蛋白質氧化過程中扮演重要角色[8-9]。近年來，由于具有可預測、可控來源等特點，2,2’-偶氮(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）有氧分解產生的烷過氧自由基模型被廣泛用作產生活性氧的誘導劑[10-11]。Wu Wei[12]、Ye Lin[13]、尤翔宇[14]、Zhou Feibai[15]等分別采用AAPH在有氧條件下熱降解產生烷過氧自由基氧化大豆蛋白、花生蛋白、米糠蛋白和豬肉蛋白，均發現烷過氧自由基會對這些蛋白質結構和性質產生重要影響，但烷過氧自由基對魚肉蛋白氧化及對其功能性質影響的研究目前仍鮮見報道。

肌原纖維蛋白是魚肉的主要組成成分，凝膠性能是肌原纖維蛋白的主要功能特性之一，凝膠質量決定了魚糜制品的品質。肌原纖維蛋白在熱誘導作用下發生變性，并通過二硫鍵、氫鍵、疏水相互作用等分子間作用發生交聯、聚集和凝膠化，進而形成高度有序的三維網絡結構[16]。凝膠網絡的質量不僅與肌原纖維蛋白結構性質有關，且受到凝膠過程的影響。熱聚集是肌原纖維蛋白凝膠過程中的關鍵步驟，其行為直接決定凝膠基質的結構和物理化學特性（即凝膠特性）；有序的熱聚集有利于形成細致的凝膠網絡，反之則易形成粗糙的凝膠結構[17]。大量研究表明，不同自由基和不同氧化途徑引起的肌原纖維蛋白氧化均會影響其凝膠性能[18-21]，而氧化對肌原纖維蛋白熱聚集行為的影響一直被忽視。鑒于此，本實驗采用不同濃度AAPH溶液有氧熱分解產生的烷過氧自由基作為氧化體系，對草魚肌原纖維蛋白進行模擬氧化，獲得不同氧化程度的肌原纖維蛋白，并在不同溫度條件下進行熱處理，研究氧化肌原纖維蛋白溶液在熱處理過程中熱穩定性、表面疏水性、Zeta電位、內源熒光光譜、濁度、粒徑分布、聚集體形貌等變化，分析氧化對魚肉蛋白的熱聚集行為的影響規律，為深入揭示氧化對魚肉蛋白凝膠性質的影響機制及凝膠品質調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚購于錦州林西街海鮮批發市場，平均體質量（2 000±30）g。

AAPH（純度97%） 上海Macklin公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS）、氯化鈉、氯化鉀、無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司；JHG-Q60-P100型實驗室均質機 上海融合公司機械設備有限公司；SORVALL Stratos冷凍高速離心機 美國Thermo公司；2.5L冷凍干燥機 美國Labconco公司；MS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2550紫外-可見光分光光度計島津儀器（蘇州）有限公司；F96Pro熒光分光光度計上海棱光技術儀器有限公司；Nano-ZS90激光粒度儀英國馬爾文公司；204 F1差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀 德國耐馳公司；Dimension Icon原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM） 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚肌原纖維蛋白的提取

新鮮草魚電擊暈后宰殺、去皮，取背部肌肉絞碎，加入5 倍體積10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2），高速均質3 次，每次30 s，4 ℃條件下5 000 r/min離心20 min，取沉淀。上述過程反復3 次，在最后一次沉淀中加入5 倍體積10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2），高速均質，4 ℃下4 500 r/min離心20 min，取上清液備用。采用雙縮脲法測定提取的肌原纖維蛋白濃度。

1.3.2 烷過氧自由基氧化肌原纖維蛋白的制備

參考Zhou Feibai等[15]的方法，將制備的肌原纖維蛋白與不同濃度（0、0.2、1.0、5.0 mmol/L）的APPH溶液以體積比2∶1混合，置于37 ℃避光條件下，在恒溫水浴中孵化24 h，并充分混勻，使肌原纖維蛋白發生不同程度的氧化。反應結束后，將反應液溫度迅速降到4 ℃以下，再將溶液在4 ℃去離子水中透析24 h除去殘余未反應的AAPH，之后取部分溶液冷凍干燥制得氧化蛋白用于熱穩定性測定，剩余溶液用于其他指標分析。

1.3.3 肌原纖維蛋白熱穩定性分析

取5～10 mg凍干的氧化后蛋白樣品于鋁盒中，采用DSC儀進行測定。參數設定為：初始溫度為20 ℃、升溫速率為5 ℃/min、結束溫度為140 ℃，對照組為空盤子，整個過程需要氮氣（0.8～1.0 Pa）保護。采用STAR軟件進行數據處理和分析得到DSC曲線。每個樣品重復3 次，取平均值。

1.3.4 表面疏水性的測定

參考S a e e d 等[22]的方法并加以修改。將樣品用20 mmol/L含0.6 mol/L KCl的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）稀釋至0～1 mg/mL，加入25 μL 8 mmol/L ANS（用20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制）后混合均勻，避光靜置10 min，然后用熒光分光光度計測定其熒光強度。測定條件為：激發波長374 nm，狹縫5 nm，掃描范圍250～500 nm。以蛋白質量濃度為橫坐標、熒光強度為縱坐標作圖，曲線初始斜率即為所求的表面疏水性指數。

1.3.5 Zeta電位的測定

采用Nano-ZS90激光粒度儀Zeta電位分析功能測定熱處理后的草魚肌原纖維蛋白溶液的Zeta電位。測定溫度為25 ℃，溫度平衡時間2 min，每組測定50～100 次。

1.3.6 內源熒光光譜的測定

將熱處理后的蛋白樣品質量濃度調整至0.25 mg/mL。采用F96Pro熒光分光光度計在激發波長295 nm條件下得到300～450 nm之間的發射光譜（靈敏度為2）。

1.3.7 濁度的測定

將氧化后肌原纖維蛋白溶液調至2 mg/mL，置于100 mL的燒杯中，用鋁箔紙封口，溫度計與轉子由中心孔插入，以1 ℃/min升溫速率水浴加熱，水浴溫度由30 ℃升至90 ℃，每升高10 ℃取5 mL樣液在350 nm波長處測定吸光度。

1.3.8 粒徑分布的測定

采用Nano-ZS90激光粒度儀測定蛋白質的粒徑分布，先用0.45 μm濾膜過濾不同氧化程度的草魚肌原纖維蛋白溶液，再配成1 mg/mL。隨后將上述不同氧化程度的蛋白溶液分裝至具塞試管中進行水浴加熱，水浴溫度由30 ℃升至90 ℃，每升高10 ℃取5 mL樣液，冷卻至室溫。然后將熱變性的蛋白液加入測量池中，測定溫度25 ℃，平衡時間1 min。

1.3.9 AFM測試

取2 μL加熱后的樣品溶液（0.1 g/mL）置于云母片上，用氮吹儀小心吹干。將樣品均勻的涂在載玻片上，放置于Dimension Icon AFM載物臺進行觀察。測試采用輕敲模式。使用Digital Nanoscope 軟件分析AFM圖片。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS statistics 19軟件中的方差分析法進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，數據繪圖采用Origin軟件。

2 結果與分析

2.1 AAPH氧化對草魚肌原纖維蛋白熱穩定性的影響

DSC法廣泛應用于蛋白質熱穩定性研究。在DSC圖譜中，最高峰對應的溫度為變性的轉變溫度，直接體現蛋白質的熱穩定性；峰面積的積分為變性焓（ΔH），反映蛋白質分子的疏水性或親水性，同時也反映蛋白質分子的聚集程度，因此可采用DSC表征結構變化所引起的焓變化及樣品結構變化信息[23-24]。AAPH氧化后草魚肌原纖維蛋白DSC分析得到的起始溫度、轉變溫度及ΔH如圖1所示，隨著AAPH濃度的增加，肌原纖維蛋白起始溫度呈現先升高再降低的趨勢，轉變溫度及ΔH變化規律較為一致。與對照組相比，0.2、1.0 mmol/L AAPH處理組的起始溫度顯著提高（P＜0.05），經5.0 mmol/L AAPH處理后又顯著下降（P＜0.05）。另外，1.0 mmol/L AAPH氧化組樣品的轉變溫度較對照組顯著提高（P＜0.05）。說明低濃度AAPH（0.2、1.0 mmol/L）氧化使草魚肌原纖維蛋白的熱穩定性增強，而高濃度氧化時使其熱穩定性下降。其原因可能是較低濃度AAPH氧化時產生二硫鍵等作用促進了蛋白質分子交聯，提高了熱穩定性；高濃度時過度氧化破壞了肌原纖維蛋白結構，使蛋白發生去折疊反應，從而導致熱穩定性下降[17]。

圖 1 不同氧化程度草魚肌原纖維蛋白的熱穩定性Fig. 1 Thermal stability of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH

2.2 AAPH氧化對草魚肌原纖維熱處理過程中表面疏水性變化的影響

圖 2 不同氧化程度草魚肌原纖維蛋白熱聚集過程中表面疏水性的變化Fig. 2 Changes in surface hydrophobicity of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白質的表面疏水性不僅能間接反映蛋白質構象，同時也能夠表征蛋白質的溶解度、穩定性及自締合的能力[25]。熱處理過程中，加熱會使蛋白質結構變性展開，造成分子內部的疏水性基團暴露出來，導致疏水性增加[26]。不同濃度AAPH氧化的草魚肌原纖維蛋白加熱過程中表面疏水性指數的變化如圖2所示。除了50 ℃下0.2 mmol/L AAPH處理的樣品外，其他氧化組樣品在不同加熱溫度時的表面疏水性指數均顯著高于對照組（P＜0.05），說明AAPH氧化破壞肌原纖維蛋白結構，導致疏水性基團的暴露。隨著加熱溫度的升高，各組樣品表面疏水性指數變化趨勢大致相同，均呈現先增加后降低趨勢。對照組和低濃度AAPH氧化組均在70 ℃表面疏水性指數達到最大值，5.0 mmol/L AAPH氧化組在60 ℃達到最大值。說明對照組和低濃度AAPH氧化組加熱到70 ℃時蛋白結構完全展開，而5.0 mmol/L AAPH氧化組樣品熱穩定性低，60 ℃時已充分展開。繼續升高溫度，表面疏水性指數下降，可能是聚集體的形成將部分疏水基團重新被包埋所致[26]。蛋白質表面疏水性增加，會使其更容易發生聚集，導致蛋白質溶解度下降，該結果也印證了2.5節肌原纖維蛋白溶液濁度的變化結果。

2.3 AAPH氧化草魚肌原纖維蛋白熱處理過程中表面電位變化的影響

圖 3 不同氧化程度的草魚肌原纖維蛋白熱聚集過程中Zeta電位的變化Fig. 3 Changes in zeta potential of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白質的Zeta電位能夠反映蛋白表面的所帶電荷情況，同時也對聚集體形成和維持體系的穩定性具有重要作用[27]。加熱過程中不同濃度AAPH氧化的草魚肌原纖維蛋白表面電位變化如圖3所示，隨著溫度的升高，不同處理組樣品Zeta電位的絕對值均呈先升高再下降的趨勢。Zeta電位絕對值的變化趨勢基本與表面疏水性指數變化一致，均在60～70 ℃左右達到最大值。這可能是因為熱處理過程中，肌原纖維蛋白變性，結構逐步展開，一些原來包埋在分子內部的帶電氨基酸殘基逐漸暴露使蛋白表面電荷增多；之后肌原纖維蛋白發生熱聚集，形成的聚集體又把部分帶電氨基酸殘基包埋起來，使表面電荷減少[28]。另外，從圖中同時可以看出，AAPH氧化后肌原纖維蛋白

Zeta電位絕對值均高于對照組，這可能是烷過氧自由基改變了肌原纖維蛋白表面電荷和氨基酸殘基的分布，使得蛋白表面靜電作用力失衡。Chen Nannan[29]、Ye Lin[30]、吳偉[31]等發現過氧自由基氧化可使大豆蛋白、花生蛋白和大米蛋白Zeta電位絕對值下降，其變化也與氧化改變蛋白表面電荷和氨基酸殘基分布、改變表面吸引力/排斥力分布有關。

2.4 AAPH氧化對草魚肌原纖維蛋白熱處理過程中內源熒光光譜變化的影響

圖 4 不同氧化程度草魚肌原纖維蛋白熱聚集過程中內源熒光光譜的變化Fig. 4 Changes in intrinsic fluorescence spectra of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白質的內源熒光主要來自于色氨酸等芳香族氨基酸殘基，通過內源熒光光譜可以了解蛋白分子多肽鏈空間結構的變化。從圖4可以看出，草魚肌原纖維球蛋白在295 nm激發波長下，色氨酸熒光光譜在335 nm左右有一個強熒光吸收值。隨著加熱溫度的升高，所有處理組樣品肌原纖維蛋白熒光強度均逐漸減少，該趨勢與Lefevre等[32]的研究結果較為一致。這可能是因為加熱后，肌原纖維蛋白變性，結構逐步展開，埋藏在分子內部的色氨酸殘基暴露于外部極性的環境，促進聚集體的形成，分子間的疏水性相互作用增強[33]。此外，從圖4中還可以看出，AAPH氧化導致肌原纖維蛋白熒光強度下降，且隨著加熱溫度的升高，氧化程度越大的樣品肌原纖維蛋白的熒光峰紅移現象越明顯。紅移表示色氨酸的微環境極性增加，即熒光發射基團暴露于高極性的水性環境中。這說明AAPH氧化處理能使肌原纖維蛋白色氨酸的微環境在熱聚集過程中變得親水，蛋白質構象更易發生變化。

2.5 AAPH氧化對草魚肌原纖維蛋白熱處理過程中濁度變化的影響

圖 5 不同氧化程度草魚肌原纖維蛋白熱聚集過程中濁度的變化Fig. 5 Changes in turbidity of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

濁度可以反映溶液中不溶懸浮粒子的大小和數量，常作為蛋白質聚集的測定指標。蛋白質在溶液中發生聚集后，顆粒直徑會變大，濁度會升高[34]。不同濃度AAPH氧化肌原纖維蛋白在加熱過程中濁度的變化如圖5所示，隨著溫度的升高，不同組樣品的濁度總體均先增加，并在達到峰值后略微降低。當樣品在40～50 ℃加熱時，對照組和低濃度（0.2 mmol/L和1.0 mmol/L）AAPH處理組濁度沒有發生顯著變化（P＞0.05）。而加熱溫度達到60 ℃時，對照組和0.2 mmol/L AAPH處理組樣品濁度達到最大值；溫度達到70 ℃時，1.0 mmol/L和5.0 mmol/L AAPH處理組樣品濁度達到最大值，繼續升高溫度，濁度變化不顯著（P＞0.05）。加熱過程中肌原纖維蛋白溶液濁度增加說明蛋白發生了變性聚集，溶液中不可溶聚集體的大小和數量均明顯增加；當升高到一定溫度時，蛋白溶液濁度趨于穩定或略降，是因為隨著溫度的升高不可溶聚集體顆粒變大，同時可能產生了沉淀，導致溶液中聚集體數量降低[35]。對照組和0.2 mmol/L AAPH氧化組樣品濁度在60 ℃時達到最大值，而1.0 mmol/L和5.0 mmol/L AAPH氧化組樣品濁度達到最高值時的溫度為70 ℃，且最大濁度均高于對照組，說明AAPH氧化一定程度上改變了肌原纖維蛋白的熱聚集規律。分析其可能原因是，肌原纖維蛋白經低濃度AAPH氧化產生二硫鍵、二聚酪氨酸等作用力并改變了其結構和構象[17]，使其分子鏈在較低加熱溫度時難以完全展開、變性和聚集，該結論與熱穩定性結果相一致。而高濃度AAPH氧化可能引起肌原纖維蛋白肽鏈斷裂和降解，降解形成的肽鏈較肌原纖維蛋白分子難以聚集，但隨著加熱溫度的升高，它們可通過非共價鍵和二硫鍵等結合形成聚集體，使溶液中不可溶聚集體數量增加，因此高濃度AAPH氧化組濁度達最高值時溫度較高、濁度較大。濁度的變化與表面疏水性的結果相一致。

2.6 AAPH氧化對草魚肌原纖維蛋白熱處理過程中粒徑分布的影響

圖 6 不同氧化程度草魚肌原纖維蛋白熱聚集過程中粒徑分布的變化Fig. 6 Changes in particle size distribution of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH during heat-induced aggregation

蛋白質在一定條件下加熱變性，通過次級鍵和二硫鍵等形成可溶性聚集體，在一定條件下可溶性聚集體進一步聚集交聯就可形成凝膠網絡，因此熱聚集體的粒徑對蛋白質的凝膠性質產生重要影響[36]。加熱過程中不同濃度AAPH氧化的草魚肌原纖維蛋白的粒徑分布變化如圖6所示，隨著加熱溫度由30 ℃升到90 ℃，對照組樣品中熱聚集體的平均粒徑逐漸增大，說明未氧化草魚肌原纖維蛋白加熱過程中發生了相對有序的熱變性聚集。0.2 mmol/L AAPH氧化組樣品粒徑變化規律基本與對照組一致。1.0 mmol/L AAPH氧化組樣品加熱過程中粒徑變化趨勢較為復雜，在30～40 ℃時粒徑變化不大，這可能是因為草魚肌原纖維蛋白經1.0 mmol/L AAPH氧化后熱變性溫度升高（由2.1節可知其熱轉變溫度為48.75 ℃），蛋白沒有發生明顯的變性和聚集；加熱溫度在50～70 ℃時，聚集體粒徑隨著溫度升高逐漸增大；進一步升高溫度（80～90 ℃）聚集體粒徑又發生了降低。5.0 mmol/L AAPH氧化組樣品在40 ℃加熱時粒徑顯著增大，這是由于該氧化樣品熱變性溫度低于40 ℃，故樣品在溫度達到40 ℃時已發生明顯聚集；繼續升高溫度，聚集體粒徑逐漸增大，當加熱溫度達70 ℃后粒徑又有所降低。此外，由圖6還可以看出，不同組樣品初始平均粒徑（30 ℃時）隨著AAPH氧化濃度的增加呈現先增加后降低趨勢。可見AAPH氧化使草魚肌原纖維蛋白聚集體粒徑發生不規則變化，上述粒徑變化規律可能是由于低濃度氧化時蛋白形成可溶性聚集體，而高濃度氧化時部分蛋白形成不可溶性聚集體，AAPH氧化使得肌原纖維蛋白在熱變性過程中形成可溶聚集體的能力下降，高溫時部分可溶性聚集體可轉化為不可溶性聚集體形成沉淀，導致平均粒徑降低[37]。

2.7 AAPH氧化對草魚肌原纖維蛋白熱聚集體形貌變化的影響

AFM技術利用納米級尺寸及pN級力靈敏度的探針在樣品表面進行逐級光柵掃描得到樣品表面的形貌。利用AFM觀察蛋白質聚集過程中微觀形態的變化能夠直觀反映蛋白溶液的聚集狀態[38]。不同濃度AAPH氧化的草魚肌原纖維蛋白加熱過程中形成的聚集體形貌如圖7所示。未氧化的草魚肌原纖維蛋白加熱過程中聚集體顆粒相對較小且分布均勻，加熱溫度越高，聚集體的顆粒也越大。經0.2 mmol/L和1.0 mmol/L AAPH氧化處理后的肌原纖維蛋白加熱過程中聚集體顆粒也隨著加熱溫度的升高而增大，但形貌特征發生了一定變化，顆粒大小不一、分布不均勻。而且相同溫度下，蛋白氧化程度越高形成的聚集體顆粒越大、數量越少。這說明AAPH氧化會使草魚肌原纖維蛋白發生不規則地熱聚集，形成大的不規則蛋白簇，且改變了熱聚集體的形貌特征。

圖 7 不同氧化程度草魚肌原纖維蛋白熱聚集過程中聚集體AFM形貌Fig. 7 AFM images of heat-induced aggregates of grass carp myofibrillar protein oxidized with different concentrations of AAPH

3 結 論

較低濃度（不高于1.0 mmol/L）AAPH氧化處理有助于增強草魚肌原纖維蛋白的熱穩定性，而高濃度（5.0 mmol/L）氧化則降低其熱穩定性。隨著加熱溫度的升高，對照組和氧化組樣品蛋白溶液的表面疏水性指數、Zeta電位絕對值、濁度呈先增加后降低趨勢。內源熒光強度隨加熱溫度的升高逐漸減少并出現紅移，且氧化程度越大，紅移現象越明顯。對照組和0.2 mmol/L AAPH氧化組樣品熱聚集體的平均粒徑隨著加熱溫度的升高逐漸增大，1.0 mmol/L和5.0 mmol/L AAPH氧化組樣品則呈先增大后減小趨勢。氧化組樣品熱聚集體大小不一且分布不均勻，隨著加熱溫度的升高聚集體顆粒增大，且氧化程度越高顆粒越大。總之，烷過氧自由基氧化顯著影響草魚肌原纖維蛋白的熱變性聚集規律，使其從有序變為無序和不規則，進一步可能會影響肌原纖維蛋白的凝膠性質。