茉莉酸甲酯誘導鄰近番茄植株抗斜紋夜蛾的濃度和距離效應

宋 佳,王 駿,葉 茂,*

1 貴州大學昆蟲研究所,貴陽 550025 2 貴州山地農業病蟲害重點實驗室,貴陽 550025

植物在與植食性昆蟲協同進化的過程中逐漸形成了多種防御機制,植物一方面可以產生單寧,酚酸,生物堿和蛋白酶抑制劑等直接抑制昆蟲的生長發育[1],另一方面植物釋放揮發性物質吸引捕食性天敵或寄生性天敵,從而對植食性昆蟲進行間接防御[2]。此外,已有很多研究證實植物間存在信息交流,植物在受到植食性昆蟲的取食后所釋放揮發性化合物,如4-異丁基苯乙酮,檸檬烯,月桂烯,羅勒烯,MeJA和水楊酸甲酯等誘導激活鄰近植株防御反應[3-4],這種植物與植物之間通過揮發性化合物進行信息交流的過程稱為“植物間通訊”[5],目前已報道有16科35種植物可以進行化學通訊[6]。在這些蟲害誘導的揮發物中,MeJA和水楊酸甲酯與植物間通訊密切相關,這兩種化合物揮發性強,可通過植物的氣孔進入植物體內,在細胞質中被酯酶水解為茉莉酸或水楊酸,從而誘導鄰近植物產生誘導防御反應[7-8]。Farmer和Ran[9]發現,被修剪的山艾樹可釋放MeJA誘導鄰近健康的番茄植株產生蛋白酶抑制劑抑制昆蟲的取食,而Karban通過田間試驗也證明山艾樹受到損傷后會釋放出大量MeJA,誘導鄰近未受傷的番茄和野生的煙草植株合成大量蛋白酶抑制劑和多酚氧化酶,而未受傷植株受昆蟲的取食明顯減少[10]。植物釋放的揮發物不僅可以誘導鄰近植物的防御,同時會影響昆蟲的行為[11],促使昆蟲轉移到鄰近其他未受危害的植株上取食[12],即昆蟲可以利用外部信號尋覓合適的取食環境或發現潛在的危險而逃離[6,11,13],因而認為鄰近受害植株不一定是“好鄰居”[14],如果植物受傷后釋放的揮發物對鄰近植株防御的誘導作用有濃度效應和距離的限制,那么對于固著生長的植物來說,通過釋放揮發物來激活鄰近植株的防御反應存在一定生態風險[15]。

斜紋夜蛾(SpodopteralituraFabricius)是一種世界性分布的廣食性害蟲,對農業生產造成極大的危害。番茄(Lycopersiconesculentum)是一種重要的蔬菜作物,并且番茄全基因組已經被測序,是研究植物與昆蟲相互作用的經典模式植物。本實驗以番茄和斜紋夜蛾為實驗材料,研究植物間重要通訊信號物質MeJA誘導鄰近番茄植株抗蟲性的濃度和距離效應,實驗結果對利用植物間通訊物質防治害蟲有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

(1)斜紋夜蛾：供試昆蟲為人工飼料在實驗室中飼養10代以上的敏感品系。溫度(25±2)℃,相對濕度60% RH,光周期14 L∶10 D。

(2)番茄：供試品種為合作903大紅番茄,以營養缽單株培育于無蟲網室,移栽20 d后,挑選生長發育整齊一致的健康番茄植株供試。生長期間不施用任何農藥。

(3)MeJA：(±)-methyl jasmonate購自美國Sigma-aldrich公司,純度為98%。

1.2 實驗處理

MeJA用少量無水乙醇溶解后,再用蒸餾水配制成濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L的溶液(含2%無水乙醇),以2%的無水乙醇水溶液為對照。在不同狹長大棚(1m ×1 m × 4 m)內按離氣味源60 cm、120 cm、180 cm、240 cm和300 cm的距離擺放番茄植株,每個距離擺放6株番茄植株,作為6個重復。在大棚空氣進口處分別噴霧不同濃度的MeJA和對照水溶液60 mL作為氣味源,不同濃度的MeJA在不同大棚中進行。噴霧MeJA后立即封閉大棚處理48 h后,檢測不同距離番茄植株葉片過氧化物酶(Peroxidase, POD),多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)和脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)的酶活性,并檢測斜紋夜蛾取食各處理番茄植株葉片后的體重增長率。

1.3 實驗方法

1.3.1番茄植株抗蟲酶活性的測定

(1)POD,PPO酶活性檢測方法

稱取番茄葉片0.1 g,液氮研磨成粉末,在液氮未揮發完前轉入離心管,加入1 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.2)(內含5%聚乙烯吡咯烷酮PVPP),在渦旋振蕩儀上渦旋振蕩10 s,低溫冷凍離心機中12000 r/min離心15 min,上清液為酶液,POD活性測定采用愈創木酚法進行[16],PPO活性測定采用鄰苯二酚法[17],酶活性最終以每毫克蛋白所含有的酶活單位(U min-1mg-1蛋白質)表示。

(2)LOX檢測方法

稱取0.1 g葉片,液氮研磨成粉末,在液氮未揮發完前轉入離心管,立即加入1 mL 0.05 mol/L Tris-HCL提取液,在渦旋振蕩儀上渦旋振蕩10 s,低溫冷凍離心機中12000 r/min離心15 min,上清液為待測酶液,以亞油酸為底物測定LOX活性[18],酶活性最終以每毫克蛋白所含有的酶活單位(U min-1mg-1蛋白質)表示。

1.3.2蛋白含量測定

蛋白含量測定采用Bradford方法[19],使用牛血清蛋白作為標準蛋白。

1.3.3檢測斜紋夜蛾體重增長率

噴霧不同濃度MeJA后立即封閉大棚,誘導處理48 h后,挑選生長發育一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲,分別接到60 cm 和300 cm處的番茄植株葉片上取食,每株番茄苗接3頭幼蟲,每個處理10株番茄,即每個處理共30個重復。取食2 d、4 d和6 d 后用萬分之一天平稱量斜紋夜蛾的體重,計算體重增長率。

1.4 數據處理及統計方法

數據分析在Statistica中進行,用Duncan多重比較法分析(P<0.05)處理間差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 MeJA對鄰近番茄植株葉片PPO酶活性的影響

離氣味源不同距離的對照組番茄植株其葉片PPO活性沒有顯著差異,而1 mmol/L 和 10 mmol/L MeJA處理48 h后,離氣味源不同距離的番茄植株葉片PPO活性呈現不同程度的變化(圖1)。1 mmol/L MeJA 處理下,以離氣味源60 cm處番茄植株葉片的酶活性最高,并隨著距離的增加有逐漸減弱的趨勢,其中60 cm和120 cm處的番茄植株其葉片PPO活性分別比相同距離的對照組高84.60%和48.65%,10 mmol/L MeJA處理下,以離氣味源240 cm和300 cm處番茄植株葉片的酶活性最高,其中180 cm、240 cm和300 cm處的番茄植株其葉片PPO活性分別比相同距離的對照組高69.06%,122.50%和110.61%。雙因素方差分析結果表明,MeJA處理濃度和距離間交互效應顯著(P=0.000363),以10 mmol/L MeJA處理下離氣味源300 cm處番茄植株葉片的PPO活性的的誘導效應最強。

圖1 MeJA對鄰近番茄植株葉片多酚氧化酶(Polyphenol oxidase, PPO)活性的影響

2.2 MeJA對鄰近番茄植株葉片POD活性的影響

對照組中不同距離番茄植株其葉片POD活性沒有顯著差異(圖2)。1 mmol/L MeJA 處理下,60 cm、180 cm和240 cm處的番茄植株其葉片POD活性分別比相同距離的對照組高260.60%,120.16% 和142.67%,而120 cm和300 cm番茄植株其葉片POD活性與對照組相比沒有顯著差異；10 mmol/L MeJA處理下,60 cm、120 cm、180 cm和240 cm處的番茄植株其葉片POD活性顯著比對照組的高309.76%,331.20%,146.72% 和134.11%,而300 cm處番茄植株葉片POD活性與對照組相比沒有顯著差異。雙因素方差分析結果表明,MeJA處理濃度和距離的交互效應顯著(P=0.000266),以10 mmol/L MeJA處理下離氣味源60 cm處番茄植株葉片的POD活性最強,隨著距離的增加而呈現逐漸減弱的趨勢。

圖2 MeJA揮發物對鄰近番茄植株葉片過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性的影響

2.3 MeJA對鄰近番茄植株葉片LOX酶活性的影響

對照組不同距離番茄植株間葉片LOX酶活性沒有顯著差異(圖3)。1 mmol/L MeJA 處理下,60 cm和180 cm處的番茄植株其葉片LOX活性顯著比相同距離的對照組的高182.23%,107.81%,而120 cm、240 cm和300 cm番茄植株其葉片LOX活性與對照組相比沒有顯著差異；10 mmol/L MeJA處理下,60 cm、120 cm和180 cm的番茄植株其葉片LOX活性顯著比對照組的高431.73%,133.41%,115.18%,而240 cm和300 cm處的番茄植株葉片LOX活性與對照組相比沒有顯著差異。雙因素方差分析結果表明,MeJA處理濃度和距離的交互效應顯著(P=0.0000),以10 mmol/L MeJA處理下離氣味源60 cm處番茄植株葉片的LOX活性最強,隨著距離的增加而呈現逐漸減弱的趨勢。

圖3 MeJA對鄰近番茄植株葉片脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)活性的影響

2.4 MeJA對鄰近番茄植株抗斜紋夜蛾的影響

研究結果表明1 mmol/L和10 mmol/L MeJA揮發物都顯著誘導提高了鄰近番茄植株對斜紋夜蛾幼蟲的抗性,其中取食1 mmol/L MeJA 處理組60 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲,其取食4 d和6 d后的體重增長率顯著比取食相同距離下對照組番茄植株葉片的低58.62%和37.78%,比取食300 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲低47.35%和23.67%(圖4)；此外,取食10 mmol/L MeJA 處理組60 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲,其取食4 d和6 d后的體重增長率顯著比取食相同距離下對照組番茄植株的低74.57%和54.91%,比取食300 cm處的番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲低16.46%和25.03%。雙因素方差分析結果表明,相同取食時間下,MeJA處理濃度和距離的交互效應顯著(P=0.0000),以10 mmol/L MeJA揮發物的誘導作用最強,且隨著距離的增加,番茄植株的抗蟲性明顯降低。

圖4 斜紋夜蛾幼蟲體重增長率變化

3 討論

生物間的化學通訊是一個普遍的自然現象,并一直受科學家們的關注[5,10,20]。植物與授粉昆蟲,植物與真菌,植物與害蟲,植物與害蟲的天敵之間都存在化學通訊[21]。近年來,大量研究發現,植物在受到植食性昆蟲的攻擊后釋放出的大量揮發性化合物,誘導增強鄰近植株的抗蟲性,在這些揮發性化合物中,MeJA參與了植物間的信息交流,與植物間的防御通訊密切相關[10,21-23]。本實驗以噴霧 MeJA 模擬番茄植株間的通訊信號,研究其作為植物間通訊信號誘導鄰近植株抗蟲性的距離和濃度效應。

POD是植物防御的關鍵酶之一,對維持植物體內自由基平衡具有重要作用,能利用過氧化氫氧化供氫體,并參與合成木質素,影響植物的感病或抗病[24]。方海濤用0.01 mmol/L、0.1 mmol/L和1.0 mmol/L 3種濃度的MeJA處理均使蒙古扁桃葉片POD 活性較對照增加,再用天幕毛蟲(MalacosomaneustriatestaceaMotsch)取食誘導后的蒙古扁桃木葉片,均降低了對葉片的消化率、轉化率和利用率[25]。LOX是一種非血紅素鐵蛋白,是植物抗脅迫響應的關鍵酶[26]。LOX基因的表達或LOX酶活性的高低都與植物的防御狀態密切相關,LOX2基因的高表達在油菜對菌核病抗性中起重要作用,參與了茉莉酸介導的菌核病抗性防御反應[27]。

本實驗研究結果表明噴霧1 mmol/L 和10 mmol/L MeJA產生的揮發物可以顯著誘導增強鄰近番茄植株葉片PPO,LOX和POD的活性,以10 mmol/L MeJA處理組植株葉片防御酶LOX和POD酶的活性最高,1 mmol/L MeJA處理組植株葉片酶活性次之,并且隨著距離的增加而呈現減弱的趨勢,表明MeJA揮發物對鄰近番茄植株的誘導抗性有明顯的濃度效應和距離效應。PPO是植物體內的一種抗營養酶類,能催化酚類化合物轉化為醌,減少食草昆蟲對植物營養的獲取[28],高濃度MeJA對PPO的活性有抑制作用[29],本研究發現1 mmol/L和10 mmol/L MeJA均能誘導番茄葉片PPO活性,1 mmol/L MeJA處理組植株葉片PPO酶的活性隨著距離的增加而呈現減弱的趨勢,而10 mmol/L MeJA處理下,PPO酶的活性隨著距離的增加而增強,也表明高濃度MeJA對PPO酶活性有抑制作用；斜紋夜蛾幼蟲體重增長率實驗結果表明斜紋夜蛾幼蟲取食不同距離番茄葉片后,其體重增長率都顯著低于對照組斜紋夜蛾,相同時間段下均以取食10 mmol/L MeJA 處理的60 cm處番茄植株葉片的幼蟲體重增長率最低,而取食對照組不同距離間番茄植株葉片的斜紋夜蛾幼蟲,相同時間段下其體重增長率沒有明顯差異,這些結果說明MeJA揮發物對鄰近植株抗蟲性的誘導有距離效應,這種距離上的限制應該是由MeJA的濃度逐漸降低引起的。

植食性昆蟲取食誘導的植物揮發物,如一些綠葉揮發物、萜類化合物等,除了可以吸引害蟲的天敵外,還可以作為植物與植物間“交流”的信號物質,誘導相鄰植物產生防御反應[30]。例如,預先用順式-3-己烯基乙酸酯cis-3-hexenyl acetate(z3HAC)熏蒸過的雜交楊樹苗葉片再被舞毒蛾(Lymantriadispar)幼蟲取食時,葉片中茉莉酸和亞麻酸含量更高。此外,z3HAC 使得一些調控茉莉酸防御信號的基因處于防御警備狀態,一旦昆蟲取食后這些基因迅速進行高表達[31],這種通過某些生物或者非生物因子刺激警備后誘導植物產生更加快速和強烈的防御反應,即稱為防御誘發或防御警備(defense priming),是一種特殊的植物誘導防御策略[32]。胡永建等研究發現蟲害誘導馬尾松鄰枝的MeJA和萜烯類化合物含量升高[33]。茉莉酸類物質浸種處理或直接噴施處理可以誘發植物防御,如研究發現預先用MeJA噴施處理的水稻植株,機械損傷時,水稻胰蛋白酶抑制劑合成基因OsBBPI和過氧化物酶基因OsPOX迅速表達,并發現 MeJA 通過調控OsBBPI啟動子區組蛋白修飾來誘發水稻防御[34]。此外,植物被激發誘導獲得的抗性可能具有遺傳特性[35]。在擬南芥中,與未受激發誘導的植物相比,受到病原物侵染誘導的植物的后代其防御相關基因顯著表達,植株抗性增強[36]。本實驗結果表明MeJA作為植株間的重要防御通訊信號,可以誘發增強鄰近番茄植株抗蟲酶活性,抑制斜紋夜蛾的取食,并且這種誘導作用有顯著的距離和濃度效應,隨著距離的增加和MeJA濃度的降低而呈現減弱的趨勢,然而,MeJA誘發鄰近不同距離間植株防御反應的時間效應及誘發的分子機制還有待深入研究。