發光細菌在線監測水體污染研究進展

王 穎，廖訚彧，歐陽莎莉，彭泓波，黃周洲，陳 斌，廖倩文

(長沙市水質檢測中心，湖南長沙 410000)

隨著信息化水平的提高，在線儀器的技術發展，水質在線監測已經廣泛應用于環保、水利、衛生、城市供排水等行業。水利部的大型飲用水源地基本都安裝了水質在線監測儀，生態環境部的國家水質自動監測預警系統也已經建成，主要水系國家斷面的數據可在中國環境監測網站國家地表水水質自動監測實時數據發布系統查看。隨著河湖長制的推行，一些城市行政分界斷面或重要河流支流斷面的自動監測站也應運而生，譬如目前，長沙一江六河共建成水質自動監測站34個。2020年1月武漢暴發疫情后，雷神山火神山醫院相繼建成，其醫療廢水排放實現了實時在線自動監測。國內外當前比較前沿的水質自動在線監測體系有3類儀表。第一類為常規多參數儀表：主要有pH、電導率、濁度、溶解氧、水溫、葉綠素、懸浮物等在線監測儀；第二類為特征污染物儀表：主要有重金屬、揮發性有機物(VOC)、氨氮、總氮、總磷、高錳酸鹽指數、總有機碳、余氯等在線監測儀；第三類為在線生物毒性儀：主要有發光細菌類、魚類、藻類、蚤類等在線監測儀。其中，常規多參數和特征污染物主要針對國家水質質量標準中的單個指標；而在線生物毒性是一個綜合水質評價指標，發光細菌在線生物毒性監測是20世紀70年代后期發光細菌與現代光電子技術結合產生的一種新的監測技術[1]。國家環境監測“十二五規劃”中提到“地表水試點監測,逐步在重要水體斷面增加重金屬和生物毒性、揮發性有機物等自動監測項目,滿足重點領域、湖庫水質預警監測要求”，這是首次國家層面的政策文件提及生物毒性在線監測。

作為一種新的水質監測技術，在線生物毒性監測技術展現了獨有的優勢，與以往在線監測方法完全不同，可以檢測重金屬、農藥、生物毒物、其他有機和無機有毒物質，體現的是一種綜合指標，能更好地預警水體中的有毒物質，更科學地避免重大突發性水污染事件風險。

關于在線生物毒性監測的研究進展，主要從各類生物傳感器角度，水生動植物類(魚類、蚤類、藻類)、微生物類(發光細菌、硝化細菌、氧化亞鐵硫桿菌)[2-4]進行綜合評述。發光細菌法是其中的一個主要方面，暫時還沒有文章從發光細菌生物毒性的角度來細分領域研究進展，本文從原理、性能指標、標準、在線生物毒性監測技術(發光細菌法)在水質監測的應用、生物毒性在線監測儀研究狀況進行闡述。

1 發光細菌監測水質生物毒性的原理和生物毒性結果的評價

1.1 基本原理

水樣在一定的時間和條件下與發光細菌接觸后，發光細菌的發光強度與水樣中毒性組分總濃度呈負相關關系，通過生物發光光度計測定水樣與發光細菌接觸15 min后的發光抑制率來表征水樣的急性毒性水平。發光細菌的生物發光反應是由于分子氧作用，細胞內熒光酶催化將還原態的黃素單核苷酸及長鏈脂肪醛氧化為黃素單核苷酸及長鏈脂肪酸，并釋放出最大發光強度在490 nm處的藍綠光。

生物毒性的表征指標為相對發光強度或抑光率，相對發光強度是測試樣本發光值(樣品管發光值)與控制樣本發光值(對照管發光值)對比后所得，結果以百分比表示。抑光率一般為正值，有時候抑光率會呈現負值，此時說明水中存在使發光菌菌數增加的有機物，即可同化有機物(AOC)及可生物氧化有機物(BDOC)。

1.2 生物毒性結果的評價

國家海洋局《污水生物毒性監測技術規程 發光細菌急性毒性測試-費歇爾弧菌法》提到，樣品毒性水平的表征方法采用檢測結果中的15 min發光抑制率H進行評價。 根據H大小將毒性等級分為3級，相應等級分別為低度毒性風險、中度毒性風險、高度毒性風險，分級方法如表1所示。中科院土壤研究所制訂的水質毒性分級標準中[5]，根據相對發光率的大小將毒性等級分為低毒、中毒、重毒、高毒、劇毒5個等級，如表2所示。

表1 污水樣品毒性風險等級評價方法Tab.1 Evaluation Method for Toxicity Risk Grade of Sewage Samples

表2 水質急性毒性分級標準Tab.2 Classification Criterion of Acute Toxicity of Water Quality

2 發光細菌監測水質生物毒性的標準

圖1 3種發光細菌類型Fig.1 Three Types of Luminescent Bacteria

表3列出了明亮發光桿菌(P.phosphore-um)[12-14]以及費氏弧菌(Vibriofischeri)[15]等所涉的國內外標準。ISO 11348的3個標準，主要區別在于費氏弧菌的狀態不同：第1標準采用的是新鮮制備的費氏弧菌；第2標準采用的是液體干細菌；第3標準采用是凍干粉細菌。其中，ISO 11348-3-2017是應用最廣泛的國際標準。涉及青海弧菌的暫時沒有標準，僅在《水和廢水監測分析方法》第四版書籍中提到。

ISO 11348-3-2017與GB 15441—1995相比，主要有以下兩點區別。(1)利用的發光菌不同，且保存菌種的溫度不同，前者用的是費氏弧菌，保存溫度為-20 ℃；后者為明亮發光細菌，保存溫度為2～5 ℃；因此，對于需要長期保存的凍干粉而言，冷凍溫度越低越好。(2)前者要求測定加入水樣前發光細菌的原始熒光強度，并根據對照試樣做出校正，避免了細菌樣品不均勻帶來的誤差影響。

表3 發光細菌監測水質生物毒性的標準Tab.3 Standard for Monitoring Water Biotoxicity with Luminescent Bacteria

3 在線生物毒性監測技術(發光細菌法)在水質監測中應用

3.1 在線生物毒性監測技術在地表水監測中的應用

常州市某水源地和武進水質自動站安裝了荷蘭Toxcontrol在線生物毒性監測儀，吳禮裕等[16]利用該儀器自2008年12月得到的25萬個數值進行綜合統計分析，給地表水和飲用水制定了預警限值。其中，武進水質自動站下限報警值為-5%，上限報警值為20%；某飲用水源地水質自動站下限報警值為-5%，上限值為15%。顧俊強等[17]采用明亮發光桿菌生物傳感器，利用在線集成實現了連續自動監測，在毒物分析、性能測試、比對方法等方面進行了研究，應用連續3年的運行數據，確定了本地水樣的靜態及動態報警限。研究表明，生物毒性在線監測技術能很好地與傳統的特定項目預警技術有機結合，可作為水質綜合性評估的有效補充，滿足飲用水源地水質在線預警需求。張迪生等[15]通過對汞、鎘等重金屬的生物毒性劑量效應進行分析，準確評估了生物毒性監測方法在飲用水源地水質監測中的預警意義，結果顯示，5種元素的生物毒性: 汞>砷>鉛>鎘>鉻，結合南京上壩飲用水源地的生物毒性數據，建立了用于評價水質安全的動態報警限。

3.2 在線生物毒性監測技術在排水監測中的應用

薛銀剛等[18]嘗試運用Toxcontrol 在線生物毒性監測儀連續自動監測某污水廠初沉池、二沉池、排水口的排水毒性，并把化學需氧量、氨氮和總磷3種排水常規理化指標作為參考，統一進行研究。研究表明，該污水廠排水口常規理化指標均達標，但連續監測和瞬時樣品的平均排水毒性為高毒，平均毒性：排水口>初沉池>二沉池。即使在理化指標達標的情況下，該排水仍具有很強的毒性；Toxcontrol 系統在用于廢水生物毒性的在線監測和評價時有較好的潛力。Kim等[19]利用Lee等[20]發明的一種多通道在線生物毒性監測儀，用于韓國2座電廠(1座核電廠、1座熱電廠)排出冷卻水的毒性監測。該儀器包含DPD2540、DPD2794、TV1061、GC2這4個通道，每個通道采用的重組發光菌株不同，對毒性的響應也不同，分別針對破壞膜、DNA、蛋白質和細胞的有毒物質的響應。利用DPD2540對核電站冷卻水樣進行測試，發現該水樣呈現劇毒狀態；當水樣按體積比1∶2和1∶1稀釋時，相對發光強度分別為1.9%和1.5%，證明稀釋水樣降低了原來水樣的毒性。

3.3 在線生物毒性監測技術在飲用水監測中的應用

周方潔等[21]分別采用WQMS2000-TOX水質生物毒性檢測儀的在線檢測方法和傳統的離線水質生物毒性檢測方法對無錫市南泉原水廠自來水進行測試。結果表明：在線監測方法的抑制率為2.12%，精密度為0.74%；離線監測方法的抑制率為2.46%，精密度為1.39%。由此可知，在線監測方法抑制率和離線監測方法相似，但精密度更高。

2015年5月1日—10月31日在米蘭舉行的世界博覽會期間，為了保證飲用水的安全，米蘭負責向世博會供水的環境機構采用了一種新型的在線生物毒性監測儀[22]分析監測供水毒性。意大利飲用水標準，水廠制備的水的余氯為0～0.2 mg/L。該在線生物毒性監測儀，采用的菌種為中國科學院南京土壤研究所的明亮發光桿菌，當余氯在0～0.2 mg/L時，此細菌的活性并不受余氯的影響。為期6個月持續毒性監測測試水樣2 435次(每90 min測試1次)、參比樣品184次(每天測試1次)，對測試結果進行統計評價，得出水樣平均抑制率為-5.5%±6.2%，空白相對標準偏差為2.0%±1.6%，樣品相對標準偏差為1.4%±1.2%，空白和樣品相對標準偏差低于歐洲標準(DIN EN ISO 11348-3-2009)[23]建議的3.0%的偏差。

3.4 應急監測

魏峰等[24]利用ToxSniffer 綜合毒性儀在豐水期對湖州區域進行水質生物毒性監測，8月和9月各發現1次其水質生物毒性超過了該區域的生物毒性上限(4.7%)。經調查發現，期間當地連降暴雨, 水源周圍地表的污染物沖刷到水庫中。據美國環保局的一項研究報告，雨水徑流存在一定的毒性。因此，采用ToxSniffer 綜合毒性儀對水源地進行生物毒性監測，15 min即可得到結果，迅速且準確，監測譜足夠寬, 能夠監測500 種以上的有毒物質, 滿足一級應急快速監測的需求。

4 發光細菌在線生物毒性監測儀研究現狀

4.1 性能指標

國內第一個生物毒性水質自動在線監測儀的標準《生物毒性水質自動在線監測儀技術要求 發光細菌法》(DB 44/T 1946—2016)[25]中提到，該儀器的基本性能指標有精密度、靈敏度、貯存溫度控制誤差、測量溫度控制誤差、最小維護周期、檢測周期、實際水樣比對試驗7項性能指標。精密度是指純水、1 mg/L硫酸鋅標準溶液、水樣各測試7次后的相對標準偏差，此標準的性能指標和范圍如表4所示，為通用的性能指標。國內外的廠家根據自身儀器的特點形成的性能指標如表5所示。

表4 地方標準性能指標及范圍Tab.4 Performance Index and Range of Local Standards

4.2 儀器組成單元

發光細菌生物毒性監測儀一般由進樣單元、菌種儲存單元、檢測單元、控制單元4部分組成，如圖2所示。

表5 國內外在線生物毒性儀典型代表測試性能指標Tab.5 Test Performance Indexes of On-Line Biological Toxicity Instrument at Home and Abroad

圖2 儀器的基本組成Fig.2 Basic Composition of Instrument

4.3 國內外主要儀器品牌型號

國外在線生物毒性監測儀的型號主要有荷蘭的Toxcontrol、德國拉爾的Toxalarm、英國的Microtox CTM、比利時的Vibriotox等。2010年，第一臺國產在線生物毒性監測儀聚光科技的Tox-2000誕生，其設計基于發光細菌法，之后在線生物毒性監測儀才逐漸發展起來。國內在線生物毒性監測儀基于原理可以分為兩類：第一類為發光細菌法，典型代表有聚光科技公司(Tox-3000)、力合科技(湖南)股份有限公司(LFTOX-2010)、北京京象環境科技有限公司(WTF5200)、深圳市朗石科學儀器有限公司(LumiFox 8000)等，基于發光細菌法(明亮桿菌和費氏弧菌)原理商品化的在線生物毒性儀占據了市場的絕大部分；第二類為斑馬魚法，典型代表有深圳市水務集團開天源(RTB 2000)，以斑馬魚為生物傳感器的商品化在線儀器只占市場的一小部分。斑馬魚卵法和發光細菌法最大的不同在于受試生物不一樣。2019年，國家發布了標準《水質 急性毒性的測試 斑馬魚卵法》(HJ 1069—2019)[26]，也預示未來此類儀器將會得到快速發展。除此之外，國內這些公司均為科研型公司，很多都多次承擔國家重點科技項目，有些更是國家工程中心和省級工程中心，具有強大的研發能力。在國家大力支持科研的形勢下，國內在線監測生物毒性儀的研發、生產呈現良好的趨勢。

4.4 發光細菌在線生物毒性監測儀的研究現狀

4.4.1 菌種制備技術發展

菌種技術的發展重點在于發光細菌凍干制劑制備技術[27]。菌種的凍干制品直接由冰晶升華制成，具有多孔結構，既能使細菌保持原有活性，又不會破環細胞的形態以及特性。冷凍干燥是將細菌懸浮液冷凍到冰點以下，從而轉變為固體結晶態，然后在低溫低壓(真空)下使固體升華而脫水的干燥方法。與新鮮菌液相比，菌種制成凍干制品后可以長期保存，簡化了發光細菌法的前期工作。楊毅紅等[28]發明了一種海洋發光細菌凍干制劑(明亮桿菌)及其制備方法，屬于微生物凍干制劑范疇。該凍干制劑包含菌泥和凍干保護劑，且經菌液制備、菌泥制備、混合、預凍和凍干等步驟制備而成。該保護劑制得的海洋發光細菌凍干粉于2～8 ℃下保存18個月后，菌種恢復發光率及菌種發光性能均維持穩定，能極大地提高海洋發光細菌菌種的保存效果和質量，便于環境毒性檢測中對菌種的使用。

4.4.2 菌種在線活化技術運用

商品化的生物在線監測儀一般維護周期為2周。發光細菌凍干粉復蘇后的有效期一般不超過10 d，聚光科技和希思迪聯合開發的T3000運用了儀器菌種自動保存和在線活化技術，將維護周期延長到28 d。趙東紅[29]發明了一種水質生物毒性在線檢測的裝置，包括制樣單元(水樣預處理單元)、機械手單元、取樣檢測單元及驅動分析單元，且制樣單元和取樣檢測單元均采用平行雙通道的技術方案，可實現參比水樣和待測水樣的同時測定，消除了系統誤差和測量偏差，設計了菌液儲存池和菌液復蘇池，通過在線活化技術實現維護周期的延長。Bodini等[22]研究了一種新型的細菌管理裝置，其由1個開瓶器和1個裝有凍干細菌的3個小瓶的冷藏室組成。整個過程編程自動運行，包括打開小瓶、添加22 mL的緩沖液復蘇細菌、丟棄耗盡的細菌等操作。

4.4.3 平行雙通道技術的應用

2010年，聚光科技TX2000采用的是單通道技術[30]，蠕動泵將空白對照液和待測樣品按順序泵入流路，同時，蠕動泵也將緩沖液和菌液泵入流路，三者混合在混合環，混勻反應一定時間后到達光電檢測裝置。此時，軟件控制光電檢測裝置獲取有用的光信號，分別得到參比光度值和樣品的光度值。為了保證系統誤差和測量誤差的消除，運用平行雙通道可以實現參比水樣和待測樣品的同時測定[31]。平行雙通道技術的運用也增加了儀器成本，主要是參比反應池和樣品反應池獨立分開、測試管路兩路、光電檢測器的增加等。

4.4.4 信息化技術

傳統的在線監測儀器，其基礎的信息處理技術為設備驅動、實時監控、數據管理、遠程預警，但這已經不能滿足水質管理的要求，因此，通過信息化技術實現數據更高層次的利用是未來發展的方向。黃靜[32]發明了一種在線生物毒性監測儀，對待測試水樣進行測試，得到水樣的水樣測試反應過程曲線以及抑制率。利用毒性物質毒性分級清單確定抑制率對應的毒性等級，利用曲線相似性算法對水樣測試反應過程曲線進行曲線形狀相似性識別，依據抑制率從標準毒性物質的反應過程測試曲線數據庫中識別相似度最高的反應過程測試曲線，并將其對應的毒性物質信息作為待測試水樣的毒性物質信息。該方法實現了對水質毒性信息的分級分類，解決了現有技術中無法對水質中毒性物質量化的問題，且通過曲線形狀相似性識別提高了分級分類的準確性。

4.4.5 移動式監測技術應用

現有的在線生物毒性監測儀基本都是安裝在固定的自動監測站點來實現各類水質的在線監測，儀器體積大，不適合野外自動運行。湯冬云等[33]發明了一種水質綜合生物毒性在線監測自動分析儀器，設置有獨特的光電檢測單元，集成度高、結構小巧、便于移動，適用于野外測試，同時自動化程度高，能夠在線實時監測，無需人工值守，且檢測靈敏度高、準確度好。

4.4.6 聯合技術應用

現有的技術中，進行生物毒性監測時，通常只使用單一生物傳感器，但不同的生物傳感器對不同污染物的反應是不同的。例如，發光菌對金屬比較敏感，而對有機物不太敏感，魚類則相反，利用單一生物的反應來判斷水體污染的情況，無法做到全面了解水污染的狀況。因此，桂子榮等[34]設計了一種基于魚類和發光菌的在線生物毒性監測儀，利用雙光路監測模塊同時監測水樣池和參比池的微生物熒光信號，并將熒光信號轉換成電信號傳遞至控制單元分析；利用行為監測器對試驗魚類的行為進行跟蹤拍攝，根據魚類群體活躍程度、魚群離散程度等群體參數變化對水體污染情況進行監測。

5 展望

國家對水環境質量監測越來越重視，基于發光細菌法的在線生物毒性監測方法從“十二五規劃”開始到“十三五”也取得了很好的進展。隨著生活水平的提高，現代社會對飲用水的水質要求也越來越高(從“合格水”轉變為“優質水”)。

(1)發光細菌毒性生物監測方法在水環境中有廣泛的應用，發光細菌菌種技術未來發展的方向：更穩定、更高靈敏度發光菌種的研究；菌種的凍干制備技術的進一步發展。

(2)發光細菌在線生物毒性監測儀的發展方向：針對飲用水低毒的特點，發光細菌在線生物毒性監測儀應向更低檢出限發展；針對廢水水體的復雜性，在線生物毒性監測儀水樣分析預處理技術是研究的主要方向；多物種同時監測可以更好地提升數據的可信度和精密度，將發光細菌生物監測儀作為基礎，與其他物種監測儀共同開發聯合技術將是發展的一個方向。隨著其他生物傳感器(斑馬魚)等標準的實行，未來在線生物毒性監測儀的種類將更加豐富，監測方式也將更加立體。