超高效液相色譜法同時快速測定陳年道菜中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸

楊坤，劉桂瓊，吳凱儀

(黔東南州食品藥品檢驗檢測中心，貴州 凱里 556012)

鎮遠陳年道菜是貴州省黔東南苗族侗族自治州地方特色名腌菜，距今已有500多年的歷史，被評為貴州省優秀產品和省級傳統食品。道菜呈棕褐色，儲藏年久，質佳美味，芳香濃郁，常用于炒肉、蒸肉和煮湯，其味十分鮮美。道菜中含有豐富的氨基酸、粗蛋白、脂肪及鈣、磷、鐵等營養成分，有報道稱用道菜加姜和紅糖熬成湯，可以治療感冒和腹瀉等病癥[1,2]。

為了延長陳年道菜的保質期，常常加入苯甲酸鈉、山梨酸鉀等食品添加劑延長其保質期，但超限量值對人體有一定的毒害作用[3]。對于食品添加劑的使用，國家標準GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規定腌漬的蔬菜中苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸的使用限量值為1.0 g/kg，糖精鈉和安賽蜜的使用限量值各為0.15 g/kg和0.3 g/kg。目前，對醬腌菜中防腐劑和甜味劑的檢測方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法和離子色譜法等[4-11]。而本文通過使用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀劑除去蛋白質，用1%的氨水溶液提取樣品，優化了樣品前處理方法，建立了UPLC法同時測定陳年道菜中3種防腐劑和2種甜味劑的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

安賽蜜質量濃度為1.00 g/L，苯甲酸質量濃度為1.00 g/L，山梨酸質量濃度為1.00 g/L，糖精鈉質量濃度為1.00 g/L，脫氫乙酸質量濃度為1.00 g/L：均購于壇墨質檢科技股份有限公司；甲醇：霍尼韋爾(中國)有限公司，色譜級；乙酸銨：科密歐化學試劑有限公司，色譜級；冰乙酸：天大化學試劑廠，分析純；氨水：天大化學試劑廠，分析純；亞鐵氰化鉀：天大化學試劑廠，分析純；乙酸鋅：科密歐化學試劑有限公司，分析純；無水乙醇：科密歐化學試劑有限公司，優級純；實驗室用水為密理博超純水系統制備的三級水。

1.1.2 乙酸銨溶液

稱取1.54 g乙酸銨，加950 mL水溶解，用冰乙酸溶液調pH值為5.28，用水定容至1000 mL。

1.1.3 亞鐵氰化鉀溶液

稱取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1000 mL。

1.1.4 乙酸鋅溶液

稱取220 g乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1000 mL。

1.1.5 儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀(配有二元高壓泵、自動進樣器、二極管陣列檢測器DAD、柱溫箱)、梅特勒S210-K型pH計、梅特勒PL2002型電子天平、西格瑪3-18K高速冷凍離心機、KQ-700DE型數控超聲波清洗器、密理博Milli-Q純水機、長風HW.SY11-KP4型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 標準系列溶液工作的配制

1.2.1 混合標準溶液的配制

分別吸取質量濃度為1.00 mg/mL的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標準儲備液4.00 mL于200 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得20.0 mg/L的混合標準溶液。

1.2.2 標準曲線

分別吸取20.0 mg/L的混合標準溶液2.50，5.0，10.0，25.0，50.0 mL至100 mL容量瓶中，用水定容，配制成0.50，1.00，2.00，5.00，10.0 mg/L的混合標準使用工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Ecilpse Plus C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流速：0.30 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長230 nm；參比波長360 nm；峰寬：40 Hz；進樣量為2 μL；流動相：A為甲醇，B為0.02 mol/L乙酸銨-乙酸溶液(pH值為5.28)。流動相洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.8 min，10%～40% B；1.8～3.0 min，40% B；3.0～3.1 min，40%～10% B；3.1～5.0 min，10% B。

1.4 樣品處理

準確稱取約0.50 g試樣于50 mL具塞離心管中，加氨水溶液(1+99) 25 mL，于60 ℃水浴加熱約5 min，然后加乙醇1 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后，加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8000 r/min離心10 min，水相轉移至50 mL 容量瓶中，殘渣樣品再提取1次后定容。取適量上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜上機測定。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長

對5種食品添加劑在波長190～400 nm范圍內進行掃描。由二極管陣列檢測器采集的光譜圖可知，5種食品添加劑的最大吸收波長在220～250 nm之間，為兼顧各化合物的靈敏度以及檢測的抗干擾性，本試驗選擇230 nm作為檢測波長，同時選擇360 nm作為參比波長。

2.1.2 流動相

5種食品添加劑的國家檢測方法，選擇甲醇和乙酸銨溶液作為淋洗液的有苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和脫氫乙酸，選擇甲醇和乙腈作為有機相、硫酸銨作為水相的有安賽蜜[12]。有文獻報道，同時測定安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和脫氫乙酸中3種以上化合物時，采用甲醇作為有機相、20 mmol/L乙酸銨作為水相的組合能取得較好的檢測效果。因此，本試驗采用甲醇和20 mmol/L乙酸銨混合溶液作為淋洗液。

2.1.3 梯度洗脫對分離效果的影響

首先，參照國標用甲醇和20 mmol/L乙酸銨(5+95)混合溶液作為淋洗液[13]，等度洗脫對5種化合物進行檢測，色譜圖見圖1。

圖1 按照國家標準方法測定的5種化合物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 5 compounds determined by national standard method

由圖1可知，5種化合物的出峰順序分別為安賽蜜、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉和脫氫乙酸。安賽蜜、苯甲酸可以很好地分離，苯甲酸和糖精鈉的分離度為1.84，不能很好地分離。

保持淋洗液的組合不變，通過改變洗脫方式，進行梯度洗脫，5種化合物的色譜圖見圖2。

圖2 梯度洗脫時5種化合物的色譜圖Fig.2 Chromatogram of of 5 compounds at gradient elution

由圖2可知，淋洗液中甲醇和乙酸銨洗脫配比的變化導致5種化合物的出峰順序發生改變，并且出峰時間均向后推遲，其中苯甲酸、糖精鈉和脫氫乙酸基本可以完全分離。

2.1.4 水相酸度對分離效果的影響

在水相B中加入冰乙酸改變B相的pH值，將B相的pH值調節到5.93時，和A相進行梯度洗脫，5種化合物的色譜圖見圖3。

圖3 B相pH值為5.93時5種化合物的色譜圖Fig.3 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.93 in phase B

由圖3可知，通過加入冰乙酸調節B相的pH值為5.93，5種化合物的出峰順序為安賽蜜、山梨酸、糖精鈉、苯甲酸和脫氫乙酸。出峰時間均向后推遲，山梨酸和糖精鈉不能很好地分離。

將B相繼續調節pH值為5.59時，5種添加劑標準溶液的色譜圖見圖4。

圖4 B相pH值為5.59時5種化合物的色譜圖Fig.4 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.59 in phase B

山梨酸和糖精鈉的分離度仍然不好。繼續加入冰乙酸調節B相的pH值為5.28時，5種化合物的色譜圖見圖5。

圖5 B相pH值為5.28時5種化合物的色譜圖Fig.5 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.28 in phase B

由圖5可知，采用冰乙酸調節流動相B的pH值到5.28時，5種化合物的出峰順序沒有變化，但出峰時間均靠前了，安賽蜜、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和脫氫乙酸峰形變得更窄，特別是脫氫乙酸基本不拖尾了，5種化合物相互間的分離度良好，可以完全分離。繼續加入冰乙酸，調節B相的pH值到5.17時，效果無太大變化，繼續加入冰乙酸，調節B相的pH值到4.96時，苯甲酸和脫氫乙酸的分離度變低，且信號開始降低，直到調節B相的pH值到3.94時，得到的標準溶液色譜圖見圖6。

圖6 B相pH值為3.94時5種化合物的色譜圖Fig.6 Chromatogram of 5 compounds at pH value 3.94 in phase B

由圖6可知，苯甲酸完全沒有信號，基線也變差了，因此選擇調節B相的pH值到5.28時效果最好。

2.2 線性范圍和檢出限

按試驗方法1.3測定一系列不同質量濃度的混合標準溶液，以各化合物的質量濃度為橫坐標，以相對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，以信噪比為3倍(3 S/N)相對應的質量濃度為檢出限，以信噪比為10倍(10 S/N)相對應的質量濃度為定量限，得到各化合物的線性關系、相關系數、檢出限和定量限，見表1。

表1 線性關系、相關系數、檢出限和定量限Table 1 Linear relationship, correlation coefficients, detection limits and quantitative limits

2.3 方法的回收率和精密度

按試驗方法1.4制備加標樣品，取一定量的混合標準溶液做低、中、高三水平加標回收試驗，每個樣品平行測定7次，計算5種化合物的回收率和精密度，結果見表2。5種化合物的平均回收率在66.43%～102.87%，相對標準偏差均小于3.2%，這表明所建立的分析方法的精密度和準確度均滿足檢測要求。

表2 回收率和精密度(n=7)Table 2 Recovery rates and precision(n=7)

續 表

3 結論

本文采用超高效液相色譜法可同時測定陳年道菜中的3種防腐劑和2種甜味劑，大大節約了試劑的消耗和縮短了分析時間。本方法操作簡單，色譜分離效果和穩定性好，并可獲得較高的精密度和準確度，適合大批量樣品的快速測定，同時為其他醬腌菜樣品的快速測定提供了參考。