微波輔助同步提取苦蕎中黃酮和多糖的工藝優(yōu)化

張歡，楊芙蓮，董丹

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

苦蕎麥屬于雙子葉廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)，又名韃靼蕎麥、烏麥或三角麥，既是一種重要的小宗雜糧作物，又是藥食兩用植物[1-3]。苦蕎麥的營(yíng)養(yǎng)豐富，有碳水化合物、蛋白質(zhì)、葡萄糖、植物固醇、多酚類、維生素、亞油酸、油酸、類胡蘿卜素、礦物質(zhì)等，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他作物，其中黃酮類化合物、多糖和蛋白質(zhì)是主要的生物活性成分，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒和預(yù)防心腦血管疾病等生物學(xué)功能[4-6]，且提取出來的黃酮和多糖可廣泛應(yīng)用于調(diào)味食品、保健食品等食品加工中，廣受人們的歡迎。目前苦蕎中黃酮類化合物的提取方法有：熱水提取、超聲波提取、微波提取和酶解等方法[7-9]；苦蕎中多糖的提取方法有：熱水提取、超聲波輔助提取和堿水提取等方法[10-12]，其提取物質(zhì)較單一，對(duì)于兩種物質(zhì)的同步提取研究較少。因此，本文以苦蕎為原料，采用微波輔助同步提取黃酮類化合物和多糖，為具有高營(yíng)養(yǎng)附加值的苦蕎產(chǎn)品研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麥：橫山縣陜北大地農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：源葉生物有限公司；亞硝酸鈉(分析純)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、硝酸鋁、無水乙醇(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖(分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸、苯酚(分析純)：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見表1。

表1 儀器與設(shè)備表Table 1 Instrument and equipment

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

苦蕎→清洗→干燥→粉碎→過篩→烘烤→微波提取→離心→上清液→含黃酮和多糖的溶液。

1.3.2 操作要點(diǎn)

1.3.2.1 粉碎

將挑選無霉、完好的苦蕎清洗，干燥后用粉碎機(jī)粉碎過篩。

1.3.2.2 烘烤

將經(jīng)粉碎后的苦蕎細(xì)粉鼓風(fēng)干燥120 ℃烘烤30 min，可以增加苦蕎茶的香氣，但是要嚴(yán)格控制烘烤時(shí)間。

1.3.3 微波輔助苦蕎總黃酮和多糖同步提取的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 液料比的選擇

在粉碎粒度為100目，微波功率為360 W，時(shí)間為90 s時(shí)，考察液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)時(shí)對(duì)苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.3.2 粉碎粒度的選擇

在液料比為20∶1 (mL/g)，微波功率為360 W，時(shí)間為90 s時(shí)，考察粉碎粒度分別為40，60，80，100，120目時(shí)對(duì)苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.3.3 微波功率的選擇

在液料比為20∶1 (mL/g)，粉碎粒度為100目，時(shí)間為90 s時(shí)，考察微波功率分別為180，360，540，720，900 W時(shí)對(duì)苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.3.4 微波時(shí)間的選擇

在液料比為20∶1 (mL/g)，粉碎粒度為100目，微波功率為360 W時(shí)，考察時(shí)間分別為30，60，90，120，150 s時(shí)對(duì)苦蕎總黃酮和多糖得率的影響。

1.3.4 微波輔助苦蕎總黃酮和多糖同步提取的響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)以上的單因素試驗(yàn)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選取粉碎粒度、微波功率、微波時(shí)間3個(gè)因素，以苦蕎中黃酮和多糖得率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)，以獲取最佳工藝參數(shù)。數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert 8統(tǒng)計(jì)軟件。因素水平編碼設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平編碼表

1.3.5 黃酮和多糖得率的測(cè)定

黃酮含量的測(cè)定采用NaNO2-Al(NO)3比色法；多糖的測(cè)定采用苯酚硫酸法。

1.3.6 待測(cè)樣品的制備

稱取一定量的苦蕎粉，用蒸餾水溶解，置于微波爐中進(jìn)行微波提取，離心得到上清液，于100 mL容量瓶定容得到黃酮待測(cè)液；另外將粗多糖的提取液加入4倍體積的無水乙醇，靜置24 h，抽濾并收集沉淀，將沉淀于60 ℃烘干，得到苦蕎粗多糖，溶解后測(cè)多糖得率。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，經(jīng)最小二乘法可得到吸光度與蘆丁濃度之間的回歸方程為：A=12.585x-0.006，R2=0.9992，根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮得率。

圖1 黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of flavonoids

2.1.2 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，經(jīng)最小二乘法可得到吸光度與葡萄糖濃度之間的回歸方程為：A=1.7257x+0.0347，R2=0.9995，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖得率。

圖2 多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of polysaccharides

2.2 微波輔助苦蕎中總黃酮和多糖同步提取條件的選擇

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 液料比的選擇

圖3 液料比對(duì)總黃酮和多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖3可知，隨著液料比的不斷增大，黃酮得率開始快速上升，當(dāng)液料比高于20∶1 (mL/g)后，上升速度變緩，可能是因?yàn)橐毫媳冗^大時(shí)，黃酮不能充分地溶解；多糖得率隨著液料比的增大逐漸下降，在液料比為20∶1 (mL/g)之前，緩慢下降，之后快速下降，因?yàn)殡S著水添加量的增多，使得其中的其他雜質(zhì)大量溶出，則多糖得率逐漸減小。隨著液料比的增加，多糖得率下降，這可能是因?yàn)殡S著液料比的增大，黃酮的溶出量增加，部分多糖隨之溶出，造成沉淀中多糖增加，致使多糖得率降低[13]。綜合考慮，選擇液料比為20∶1 (mL/g)較適宜。

2.2.1.2 粉碎粒度的選擇

圖4 粉碎粒度對(duì)總黃酮和多糖得率的影響Fig.4 Effect of crushing particle size on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖4可知，總黃酮和多糖得率均隨著粉碎粒度的減小先增大后減小，當(dāng)粉碎粒度大于100目時(shí)，苦蕎中的黃酮和多糖得率逐漸增大；當(dāng)粉碎粒度為100目時(shí)，黃酮和多糖的得率都達(dá)到最大值；粉碎粒度小于100目時(shí)，黃酮和多糖的得率均開始下降，其中黃酮下降較平緩。

2.2.1.3 微波功率的選擇

圖5 微波功率對(duì)總黃酮和多糖得率的影響Fig.5 Effect of microwave power on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖5可知，苦蕎黃酮和多糖得率在微波功率為360 W時(shí)達(dá)到最大值，其隨著微波功率的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)。這可能是通過電磁波的輻射作用，使得物料的溫度升高，且壓力增大，進(jìn)而使細(xì)胞破碎，其有效成分流出并溶解，但功率過大，微波作用會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使一些除黃酮和多糖之外的物質(zhì)溶解度增大，且溫度升高，導(dǎo)致部分多糖發(fā)生水解，進(jìn)而使得黃酮和多糖的得率下降[14]。

2.2.1.4 微波時(shí)間的選擇

圖6 時(shí)間對(duì)總黃酮和多糖得率的影響Fig.6 Effect of time on the yield of total flavonoids and polysaccharides

由圖6可知，苦蕎黃酮和多糖在微波時(shí)間為90 s時(shí)達(dá)到最大值，而后開始下降。這可能是因?yàn)橐欢〞r(shí)間的微波輻射導(dǎo)致細(xì)胞破碎，黃酮和多糖溶出量增大，但微波時(shí)間較長(zhǎng)使得黃酮和多糖的穩(wěn)定性降低，并且微波時(shí)間延長(zhǎng)，熱量聚集，破壞了黃酮和多糖的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而其得率減小[15]。

2.2.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定液料比的條件，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇粉碎粒度(A)、微波功率(B)、時(shí)間(C)進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，確定總黃酮和多糖的最佳同步提取條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

表3 苦蕎黃酮得率響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 3 Response surface analysis scheme and results of tartary buckwheat flavonoids’ yield

2.2.3 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4和表5。采用Design-Expert 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到苦蕎黃酮和多糖得率二次多項(xiàng)回歸方程：黃酮得率=1.11+0.10A+0.075B+0.054C+0.071AB+0.071AC-0.058BC-0.16A2-0.19B2-0.18C2；多糖得率=11.78+1.34A+0.49B+1.02C-0.25AB+1.35AC-0.48BC-2.02A2-1.70B2-1.73C2。

表4 黃酮得率回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of flavonoids' yield

續(xù) 表

表5 多糖得率回歸模型方差分析 Table 5 Variance analysis of regression model of polysaccharides’ yield

由回歸模型的方差分析結(jié)果可知，粉碎粒度、微波功率和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)黃酮得率的影響極顯著，時(shí)間和交互項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)黃酮得率的影響顯著；因素A，B，C和交互項(xiàng)AC以及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)多糖得率的影響極顯著，交互項(xiàng)BC對(duì)多糖得率的影響顯著，而交互項(xiàng)AB對(duì)多糖得率的影響不顯著。

由表4和表5可知，黃酮和多糖的P值均<0.0001，表明響應(yīng)面回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃酮的信噪比Adeq Precision的值很高，為16.007，即該模型可用于預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)的F值為0.38，表明使用該方程進(jìn)行擬合的效果較好；模型的校正確定系數(shù)R2=0.9784，說明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小。另外，多糖的信噪比Adeq Precision的值很高，為19.754，即該模型可用于預(yù)測(cè)；失擬項(xiàng)F值為2.60，表明使用該方程進(jìn)行擬合的效果較好；模型的校正確定系數(shù)R2=0.9873，說明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小；因此，可用此模型對(duì)不同提取條件下苦蕎總黃酮得率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.2.4 響應(yīng)曲面分析

圖7 各因素間交互作用對(duì)黃酮得率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of interaction between factors on flavonoids’ yield

圖8 各因素間交互作用對(duì)多糖得率的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of interaction between factors on polysaccharides’ yield

由圖7和圖8可知，響應(yīng)面圖及等高線圖比較直觀地反映了各因素及兩因素間的交互作用對(duì)黃酮和多糖得率的影響。由兩兩因素的交互作用的3D響應(yīng)面圖可知，各因素間的交互作用較強(qiáng)，其中曲線走勢(shì)越陡峭表明對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著；反之越平滑影響越小[16]。其中黃酮和多糖的響應(yīng)面都有極值，也就是都有最高點(diǎn)。

通過Design-Expert 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，苦蕎黃酮和多糖的最佳同步提取條件為：液料比20∶1 (mL/g)、粉碎粒度為108目、微波功率為388 W、時(shí)間為99 s，得到的預(yù)測(cè)黃酮得率為1.138%，多糖得率為12.4%。考慮實(shí)際操作，將試驗(yàn)條件修正為：液料比20∶1 (mL/g)，粉碎粒度為100目，微波功率為360 W，時(shí)間為99 s。

2.2.5 苦蕎黃酮和多糖最佳同步提取條件驗(yàn)證試驗(yàn)

在液料比20∶1 (mL/g)、粉碎粒度為100目，微波功率為360 W，時(shí)間為99 s的條件下，重復(fù)提取3次，測(cè)得黃酮得率為1.126%，多糖得率為12.38%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，偏差較小。說明得到的回歸模型與實(shí)際情況擬合很好，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可行性。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面分析，得到了苦蕎黃酮和多糖的同步最佳提取工藝條件為：液料比20∶1 (mL/g)、粉碎粒度為100目、微波功率為360 W、時(shí)間99 s，苦蕎黃酮得率為1.126%，多糖得率為12.38%。利用微波輔助同步提取苦蕎黃酮和多糖，相對(duì)于熱水提取來說，大大地縮短了提取時(shí)間，降低了提取成本，增加了經(jīng)濟(jì)效益，為進(jìn)一步研究苦蕎黃酮和多糖的同步提取提供了有益的參考。