青方腐乳中丁酸梭菌分離鑒定及與乳酸菌共培養研究

馬艷莉，段哲，梁靜靜，李素萍，丁玉峰，劉亞瓊*

(1.南陽理工學院河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004； 2.河北農業大學 食品科技學院，河北 保定 071000)

益生菌是通過改善宿主微生態環境，提高宿主健康水平的一類有益微生物。丁酸梭菌是近年來備受關注的有利于人體健康的微生物，研究表明，丁酸梭菌可以改善腸道菌群，提高人體免疫力，預防惡性腫瘤發生[1-3]，但其主要代謝產物丁酸通常呈現臭味，容易破壞食品風味，導致丁酸梭菌不能廣泛應用于食品生產，然而，丁酸是青方腐乳的關鍵風味物質，對青方腐乳風味有積極貢獻作用[4]，因此青方腐乳可作為丁酸梭菌的良好載體。乳酸菌是目前食品中廣泛應用的益生菌[5,6]，研究表明，在腐乳后發酵過程中，乳酸菌對促進產品風味起重要作用[7]。

腐乳作為傳統調味品，歷史悠久、營養豐富、滋味鮮美，但其含鹽量較高，且存在一些其他食用安全隱患[8]，限制了產品消費，阻礙了其工業化、國際化進程。腐乳生產使用較多食鹽的主要目的是抑制有害菌生長、控制酶活[9]，而丁酸梭菌和乳酸菌可以抑制有害菌生長，所以可考慮一定程度上代替食鹽用于生產腐乳。

益生菌共培養具有重要研究和應用價值，可以產生很多純培養所不能達到的效果，已有文獻報道，益生菌共培養可明顯提升菌株的生理代謝能力和生物量，并產生高于純菌培養的抑菌能力等[10]。已有大量研究報道丁酸梭菌能夠促進腸道有益菌增殖、抑制致病菌生長[11,12]，但丁酸梭菌與乳酸菌共培養報道較少。

本研究在前期實驗發現青方腐乳富含丁酸及丁酸梭菌基礎上，使用亨蓋特厭氧法從青方腐乳中分離丁酸梭菌，進行分子生物學鑒定，并研究其與乳酸菌共培養特性，以期為益生菌在青方腐乳中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用乳酸菌為實驗室從腐乳中分離保存，命名為LB01；丁酸、乳酸標準品：色譜純，購自Sigma公司；乙腈：色譜純，購自Dima公司；乳酸菌瓊脂培養基、MRS瓊脂培養基、PCA培養基、MRS肉湯培養基、PDA培養基：購自北京奧博星生物技術有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉：購自OXOID公司；菌株測序工作送至北京市理化分析測試中心檢測。

1.2 儀器與設備

UV mini 1240紫外-分光光度計、LC-10A高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；HPS-250生化培養箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠；超凈工作臺 北京冠鵬凈化設備有限責任公司；F-23 pH 計(精度0.001 g) 日本Horiba公司；YXQ-SG46-280A蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AR 2140電子天平 美國Ohaus公司；HZQ-F160振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；KQ-100E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 丁酸產生菌的分離鑒定方法

1.3.1.1 丁酸梭菌增殖培養基(RCM培養基)的配制方法

胰蛋白胨5 g、0.5% 美藍0.1 mL、三水合乙酸鈉1.5 g、酵母浸膏1.5 g、氯化鈉2.5 g、牛肉浸膏5 g、半胱氨酸鹽0.25 g、瓊脂0.75 g(固體培養基添加)、葡萄糖2.5 g、蒸餾水500 mL，調節pH 值為7.0，滅菌20 min后備用。

1.3.1.2 丁酸梭菌選擇性培養基(TSN培養基)的配制方法

瓊脂0.25 g(固體培養基添加)、酵母浸膏5 g、多粘菌素0.025 g、胰蛋白胨7.5 g、亞硫酸鈉0.5 g、新生霉素0.01 g、枸櫞酸鐵0.25 g、蒸餾水500 mL，調節pH值為7.0，滅菌20 min后備用。

1.3.1.3 丁酸產生菌的分離培養方法

取新鮮的青方腐乳樣品5.0 g，加45 mL無菌水充分混勻，取混合液0.5 mL接種入裝有4.5 mL丁酸梭菌增殖培養基的滾管中，在37 ℃條件下富集培養，隔24 h進行一次傳代，連續傳代4～5次。將發酵液進行梯度稀釋，丁酸梭菌選擇性培養基在滾管中融化，接種，快速混勻，放置冰槽中，連續滾動至培養基凝固，放置于培養箱中，在37 ℃靜置培養，待菌落形成后，將單個菌落轉移至液體培養基中進行擴大培養，該操作重復3～4 次，純化每個單菌落。

1.3.1.4 丁酸產生菌篩選

為篩選丁酸產生菌株，采用HPLC 法對單菌株24 h發酵液中丁酸的含量進行檢測。丁酸的檢測方法參照Zhang等[13]的方法，略有改動。量取菌株發酵液40 mL，超聲振蕩30 min，8000 r/min離心20 min，取上清液，過0.45 μm濾膜制得樣品提取液。在色譜柱：Shimadzu SCR-101H(10.0mm×7.9 mm×300 mm)；流動相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm的色譜條件下進樣檢測，與丁酸標準品上樣制得的標準曲線比對計算得丁酸含量。

1.3.1.5 丁酸產生菌鑒定

為對丁酸產生菌進行鑒定，測定篩選菌株16S rDNA，并結合顯微觀察、菌落形態、生理生化指標進行。

1.3.2 乳酸菌發酵劑的制備

將乳酸菌LB01以2%的接種量接種于MRS 肉湯培養基中，在37 ℃培養箱中活化24 h，傳代3次后對活化好的菌種進行馴化。馴化過程不斷加大MRS肉湯培養基中豆漿的比例，從0% 以10%的梯度逐步增加到100%，每次均在37 ℃培養箱中馴化24 h，將馴化好的菌種以2%接種于100 mL滅菌豆漿中，在37 ℃培養12 h后于4 ℃冷藏。

1.3.3 菌懸液制備

將乳酸菌L丁酸梭菌BP01分別接種在MRS固體培養基和梭菌增殖固體培養基上，于恒溫恒濕培養箱中37 ℃培養48 h，加入適量生理鹽水，充分搖動，分別得到菌懸液，鏡檢計數，調整其濃度為1×107CFU/mL。

1.3.4 乳酸和丁酸含量測定

使用HPLC法，量取菌株發酵液40 mL，超聲振蕩30 min，8000 r/min離心20 min，取上清液，過0.45 μm濾膜制得樣品提取液。色譜柱：Shimadzu SCR-101H(10.0 mm×7.9 mm×300 mm)；流動相：5 mmol/L的硫酸水溶液；柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm的色譜條件下進樣檢測，與乳酸、丁酸標準品上樣制得的標準曲線比對計算得乳酸、丁酸含量。

1.3.5 微生物菌落計數

稱取新鮮樣品5 g，加入45 mL滅菌的生理鹽水，渦旋振蕩10 min后，安靜放置20 min，取1 mL放入9 mL生理鹽水中，進行依次10倍的梯度稀釋，在適宜的稀釋度下進行菌落的計數。細菌在37 ℃條件下，在平板計數瓊脂上培養48 h后計數。芽孢菌數使用營養瓊脂于37 ℃培養48 h后計數。乳酸菌使用MRS培養基于37 ℃培養48 h計數。丁酸梭菌使用RCM瓊脂培養基于37 ℃厭氧培養48 h后計數，結果以log CFU/g 樣品表示。

1.4 數據處理與分析

方差分析使用SPSS 23.0 軟件開展，使用鄧肯氏多重域檢驗分析數據間的差異性，顯著水平選擇 p<0.05。每個樣品進行2次重復，取平均值。

2 結果與分析

2.1 青方腐乳中丁酸梭菌的分離鑒定

丁酸梭菌是促進腸道微生態健康的一類重要益生菌，前期研究初步確定了青方腐乳中含有丁酸梭菌，為了利用青方腐乳中的丁酸梭菌，發揮其在微生態方面的健康促進作用，本研究采用亨蓋特厭氧方法對青方腐乳中的丁酸梭菌進行分離培養(見圖1)，共選取單菌落12 株，分別測定培養液中的丁酸含量，從而初步篩選丁酸產生菌株。

圖1 亨蓋特厭氧法分離培養丁酸梭菌Fig.1 Isolation and culture of Clostridium butyricum by Hungate anaerobic method

菌株代謝產物中丁酸含量測定采用HPLC法進行，測定結果見圖2。

圖2 分離菌株代謝產物中丁酸含量的HPLC測定結果Fig.2 The butyric acid content of metabolites in isolated strains determined by HPLC method

由圖2可知，在篩選出的12株菌中存在2株高產丁酸，分別命名為丁酸產生菌株01(BP01)和丁酸產生菌株02(BP02)，后續實驗以此2株菌為實驗對象。BP01和BP02菌株培養液中(發酵48 h)的丁酸含量分別達到6.48，3.27 mmol/L。選擇BP01菌株進一步進行分子生物學的鑒定，提取該菌株的基因組DNA，以其DNA為模板進行16S rDNA擴增，對目的條帶回收后進行克隆測序，結果表明，BP01菌株的16S rDNA基因序列長度為1449 bp，將該序列在GeneBank中進行相似性的比對。

將BP01菌株的16S rDNA序列提交NCBI，使用Blast 程序進行比對分析，共發現16 個同源性最高的菌種(見表1)，對其分析發現這16個菌株均為丁酸梭菌，因此，可以從分子生物學角度判定BP01菌株為丁酸梭菌。

對BP02 菌株16S rDNA 的RCR 擴增產物進行測序，其16S rDNA基因序列長度為1377 bp，進一步在NCBI上進行相似性比對，初步確定其為雙酶梭菌(Clostridiumbifermentans)，在NCBI 上的登錄號為：JX267051.1，鑒于BP01菌株丁酸產生量較大，并且其作為益生菌認可度較高，因此，后續實驗以BP01菌株作為研究對象。

表1 NCBI上與BP01菌株同源性較高的菌株Table 1 The strains with high homology with BP01 in NCBI

續 表

2.2 丁酸梭菌與乳酸菌共培養對乳酸菌的影響

共培養又稱混菌培養或混合培養，也稱混合發酵，由于不同微生物群體之間可能存在互利共生的關系，因此，當將幾種微生物共培養時，可能產生優于單菌培養的效果。有學者的研究顯示，菌株混合培養在提高菌株生理代謝功效及生物量方面效果明顯，可產生比純培養更好的效果[14,15]。乳酸菌和丁酸梭菌作為人和動物腸道的益生菌有互利共生的潛在可能性，因此，本研究對從腐乳中分離的乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01進行共培養研究。結果表明，乳酸菌LB01單獨培養時，發酵液pH 值迅速降低(見圖3)，將丁酸梭菌BP01與其共培養，發酵液pH值降低速度減緩，在培養24 h 時，兩種發酵液pH值差異顯著(p<0.05)，進一步對乳酸菌LB01單獨培養和與丁酸梭菌BP01共培養過程中乳酸濃度進行測定，結果見圖4。乳酸菌LB01單獨培養時，發酵液乳酸含量迅速增加，在發酵24 h時達到34.6 mmol/L，而與丁酸梭菌BP01共培養時，乳酸濃度增加相對緩慢，且與乳酸菌LB01單獨培養時差異顯著。這可能是由于共培養時，丁酸梭菌BP01消耗了部分乳酸，延緩了發酵液中乳酸含量的增加和pH值的降低。這與前期實驗中發現丁酸梭菌BP01可以利用乳酸支持生長相一致，也和乳酸菌與丁酸梭菌的益生特性相符。人和動物腸道中存在大量乳酸菌，代謝產生乳酸，而健康人的糞便中幾乎檢測不到乳酸，這和腸道中存在的丁酸梭菌等益生菌利用乳酸調節腸道pH 值，防止因乳酸積累引起酸中毒相關。

圖3 發酵液pH值變化曲線Fig.3 Changes in pH values of fermentation broth

圖4 發酵液乳酸濃度變化曲線Fig.4 Changes in lactic acid concentration of fermentation broth

使用MRS 培養基對發酵24 h 的發酵液中乳酸菌進行計數，結果見圖5。乳酸菌LB01單獨培養24 h 時，發酵液中菌株數量達7.5×107CFU/mL，與丁酸梭菌BP01共培養時，乳酸菌LB01的生長沒有受到抑制，相反，丁酸梭菌BP01 有促進乳酸菌LB01生長的現象，共培養24 h后，乳酸菌LB01數量達9.8×107CFU/mL，這表明丁酸梭菌BP01能很好地促進乳酸菌LB01生長，可使其發酵24 h的活菌數提高30.7%。

發酵24 h后，丁酸梭菌BP01與乳酸菌LB01共培養的活菌數要明顯高于丁酸梭菌BP01單獨培養的活菌數，分別為10.8×106CFU/mL和6.5×106CFU/mL，表明乳酸菌LB01對丁酸梭菌BP01具有很好的促生長作用。進一步對培養24 h的發酵液中丁酸含量進行測定，見圖7。

圖5 培養24 h的發酵液中乳酸菌數量Fig.5 The number of lactic acid bacteria in fermentation broth cultured for 24 h

2.3 丁酸梭菌與乳酸菌共培養對丁酸梭菌的影響

對培養24 h的發酵液中丁酸梭菌數量進行測定，結果見圖6。

圖6 培養24 h的發酵液中丁酸梭菌數量Fig.6 The number of Clostridium butyricum in fermentation broth cultured for 24 h

圖7 培養24 h的發酵液中丁酸含量Fig.7 The butyric acid content in fermentation broth cultured for 24 h

由圖7可知，丁酸梭菌BP01單獨培養24 h，發酵液中丁酸含量可達6.5 mmol/L，與乳酸菌LB01共培養時，發酵液中丁酸含量明顯上升，培養24 h 時達到10.2 mmol/L，而乳酸菌LB01單獨培養時，發酵液中未檢測到丁酸，進一步驗證了乳酸菌LB01和丁酸梭菌BP01有很好的互利共生關系，可以在后續實驗中進行共同培養發酵。目前已有學者使用復合益生菌開發新產品，提升產品品質，例如，胡強等[16]將分別來自于動物和植物的益生菌共培養開發了新型復合益生菌調味筍，提升了產品的益生功效。

3 結論

本研究在前期實驗基礎上從青方腐乳中分離出丁酸產生菌，分子生物學鑒定為丁酸梭菌，丁酸梭菌BP01與乳酸菌LB01共培養實驗發現，二者具有互利共生關系，丁酸梭菌BP01 可以促進乳酸菌LB01生長，使其發酵24 h的活菌數提高30.7%，可防止乳酸過度積累，乳酸菌LB01也可促進丁酸梭菌BP01生長，共培養24 h發酵液中丁酸含量明顯上升，由單獨培養6.5 mmol/L增加為10.2 mmol/L，研究結果可為益生菌在青方腐乳中的應用奠定基礎。