魯氏酵母不同時間的添加對高鹽稀態醬油的影響

韓冉，張珊，余倩倩，侯麗華

(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津 300457)

醬油是東亞國家的重要調味品之一，距今已有上千年的歷史，伴隨著人們對醬油風味的高要求，市場中醬油品種也日趨多樣化，高鹽稀態發酵醬油因其獨特的風味具有較大的市場前景。高鹽稀態發酵醬油與一般醬油制法不同之處在于成曲后加入原料總重2～2.5倍的18%～20%鹽水，并且通過添加耐鹽酵母菌增加醬油的風味和提高醬油的品質[1]，發酵時間較長，一般為4～6個月。

魯氏酵母(Saccharomycesrouxii，簡稱S酵母)，是一種耐高滲透壓酵母菌，其在含鹽量18%的生長條件下仍具有活力。將該種酵母應用于高鹽稀態發酵醬油中可將糖類物質繼續分解，從而生成醇類、酯類、酮類、酸類等香氣成分，賦予醬油醇香濃郁的新風味。已有研究表明，微生物的添加方式與醬油的風味息息相關[2]。目前對于不同時間添加魯氏酵母于高鹽稀態醬油發酵中的研究相對較少。本文通過測定相關理化指標和對比風味物質研究魯氏酵母對高鹽稀態發酵醬油的影響，為醬油企業添加耐鹽酵母提供了理論支撐。

1 材料與方法

1.1 原料及菌株

原料：豆粕、炒小麥。

菌種：米曲霉滬釀3.042、酵母S1(魯氏酵母菌CBS732)和酵母S2(魯氏酵母菌JBCC-49)，為本實驗室保藏菌種。

1.2 實驗方法

1.2.1 制曲工藝

1.2.1.1 種曲制備

按麩皮∶水為1∶1.1的比例拌水，滅菌處理后接種3～4環孢子，32 ℃恒溫堆積培養。15 h后振蕩打散曲料，然后調溫至30 ℃平鋪培養，7 h后第二次振蕩打散，3 d后將成熟種曲烘干備用。

1.2.1.2 大曲制備

原料(豆粕與炒小麥比為6∶4)500 g，其中豆粕經1.1倍溫開水浸泡30 min至充分吸水，隨后原料經曲布包扎后進行高壓滅菌處理。滅菌后將曲料及時打散，曲料溫度降到40 ℃時拌入種曲(原料質量的0.4%)并充分混勻，30 ℃堆積培養。12～16 h后，第一次翻曲，繼續培養6～8 h，第二次翻曲。28 ℃進一步培養，培養40 h至大曲原料呈均勻的黃綠色，即為成曲。

1.2.2 發酵工藝

將成曲收入發酵容器中，加入20%的鹽水(原料干重2.5倍)攪拌均勻，封口進行發酵，初始發酵溫度15 ℃，每天升高1 ℃，30 ℃封頂，共發酵150 d，發酵過程中定期攪拌。在發酵第15，30，45天分別添加S1、S2酵母菌，添加量均為2×105CFU/g。

1.2.3 醬油發酵過程中指標的測定

發酵過程中每15 d進行一次取樣，直至第150 天。取樣醬醪在8000 r/min條件下離心6 min后得上清，對其各指標進行跟蹤測定。

1.2.3.1 總酸的測定

總酸含量按照國標GB/T 5009.39-2003[3]規定的方法測定。

1.2.3.2 氨基酸態氮的測定

氨基酸態氮含量按照國標GB/T 5009.39-2003規定的方法測定。

1.2.4 發酵結束后指標的測定

1.2.4.1 液相色譜測定分析有機酸

色譜柱：Hydrosphere C18(250 mm×4.6 mm I.D.)流動相：0.03 mol/L KH2PO4(磷酸調pH為3.0)；紫外檢測器波長：215 nm；流速：0.5 mL/min；進樣量：20 μL。

1.2.4.2 固相微萃取-氣質聯用(SPME-GC-MS)測定分析風味物質

GC-MS條件：GC條件：采取程序升溫，起始溫度40 ℃，保持10 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以4 ℃/min升至180 ℃，最后以6 ℃/min升至220 ℃；進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，不分流進樣；MS條件：接口溫度為220 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為EI，電子能量為70 eV，質量掃描范圍為33～450 amu[4,5]。

2 結果與分析

2.1 醬油發酵過程中總酸的測定

在高鹽稀態發酵過程中，醬油中酸類物質增加，主要來自產酸菌產生乳酸、乙酸等酸類物質[6]，還包括檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、丙酸等有機酸。適量酸味可以中和醬油中的咸味，使醬油滋味變得柔和，但是總酸含量太高時也會使醬油的味道和氣味變差[7]。

(a)

(b)

由圖1中(a)可知，S1酵母最終發酵的總酸含量15 d+S1<45 d+S1<30 d+S1<空白，數值分別為1.18，1.19，1.28，1.42 g/dL；由圖1中(b)可知，S2酵母最終發酵的總酸含量30 d+S2<15 d+S2<45 d+S2<空白，數值分別為1.28，1.34，1.41，1.42 g/dL。發酵后期，添加酵母發酵組的酸類物質被利用生成酯類、醛類等其他風味物質，因此其總酸含量均低于空白組的總酸含量。

2.2 醬油發酵過程中氨基酸態氮含量的測定

醬油原料中蛋白含量豐富，發酵過程中經酶水解成小分子的肽和氨基酸，也就是醬油中主要的呈鮮物質[8]，決定醬油的分級。

(a)

(b)

由圖2可知，發酵初期，氨基酸態氮含量快速增加，蛋白酶系活力旺盛，此外在高濃度鹽水的滲透壓作用下，原料中的可溶性氮和鈉離子發生快速交換，導致發酵液中氨基酸態氮持續增加。發酵后期，醬醪中微生物代謝消耗掉一部分氨基酸態氮，最終生成與消耗速率平衡，含量逐漸趨于穩定。由圖2中(a)可知，S1酵母最終氨基酸態氮含量空白<45 d+S1<15 d+S1<30 d+S1，數值分別為0.91，0.92，0.98，1.00 g/dL，S1在第30 天添加時較優；由圖2中(b)可知，S2酵母最終氨基酸態氮含量為空白<30 d+S2<15 d+S2<45 d+S2，數值分別為0.91，0.94，0.95，0.97 g/dL，S2在第45天添加時較優。各組在發酵結束時氨基酸態氮含量均>0.80 g/dL，符合國標GB/T 18186-2000中特級醬油的相關規定。

2.3 有機酸含量檢測

有機酸賦予醬油香氣，并且中和高鹽分帶來的咸味，對醬油的口感起調節作用[9]。醬油中的有機酸以乳酸為主。本實驗通過高效液相色譜法進行檢測與分析，各個發酵組的有機酸含量見表1，各發酵組的有機酸種類基本一致。琥珀酸入口呈爽口酸味；乙酸等在烹飪過程中可與醇類等反應，生成具有特殊風味的酯類；草酸含量過量會危害人體健康，各組草酸含量均在國標范圍內。30 d+S1組乙酸和琥珀酸含量均高于15 d+S1組和45 d+S1組；45 d+S2酵母組中乙酸和琥珀酸含量均高于15 d+S2組和30 d+S2組。

表1 添加單種酵母發酵組中有機酸含量Table 1 The content of organic acids in the fermentation group adding single yeast

2.4 風味物質檢測

表2 添加單種酵母發酵組風味物質種類的比較Table 2 The types of flavor substances in the fermentation group adding single yeast

在所有的風味物質中，酯類物質作為醬油的主要香氣成分所占比重最大，見表2。對比各發酵組，30 d+S1發酵組中酯類物質種類最多，為25種。其次占比大的是醇類物質，經檢測，乙醇、異戊醇和苯乙醇含量較高，總體占醇類物質的90%以上，乙醇主要來自以酵母利用糖類進行的酒精發酵過程[10,11]，異戊醇和苯乙醇均由氨基酸經Ehrlich反應生成，苯乙醇是具有薔薇花香氣的化合物[12]。此外，重要風味組成成分3-甲硫基丙醇和1-辛烯-3-醇也在添加耐鹽酵母S1的發酵組中被檢測到[13,14]。由表2可知，30 d+S1發酵組中檢測到的醇類物質種類較多，為20種。醛類物質的簡單化合物具有強烈的刺激性香氣，而且醛類與醇類等反應均可產生不同于本身的香氣，例如，異戊醛與硫化氫共存時可以形成強烈的焦香氣味。本實驗中檢測到的主要醛類物質有異丁醛、異戊醛、苯甲醛和苯乙醛。在各發酵組中，45 d+S2發酵組中檢測出的醛類和酮類物質種類高于其他組。醬油的酸類物質也關系到產品的香氣，45 d+S2酵母組的酸類物質種類最高。此外，30 d+S1組與45 d+S2組的總風味物質種類較高，分別為71種和72種。

2.5 不同時間添加兩種酵母有機酸含量及風味物質種類

由上述結果可知，添加單種酵母時，30 d添加S1酵母較佳，45 d添加S2酵母較佳。為了達到更好的發酵效果，采用S1、S2酵母不同時間混合添加的方法進行驗證，即30 d+S1+45 d+S2組。發酵最終總酸含量為1.42 g/dL，總氨基酸態氮含量為1.01 g/dL。

表3 不同時間添加多種酵母發酵組有機酸含量及風味物質種類的比較Table 3 Comparison of content of organic acids and types of flavor substances in the fermentation group adding various yeasts at different time

由表3可知，30 d+S1+45 d+S2組中重要酸類物質蘋果酸、乳酸、乙酸、富馬酸以及琥珀酸的含量均高于30 d+S1組和45 d+S2組；在風味物質種類的檢測中，30 d+S1+45 d+S2組也呈現出明顯優勢，最終種類達到78種。經驗證，最佳發酵方法為第30 天添加S1酵母后在第45 天添加S2酵母。

3 結論

在單一酵母發酵實驗中得知同一種酵母不同株添加時間的不同對發酵效果影響不同，因此需要分別進行條件優化，從而得到最佳發酵方式。根據單一酵母實驗推斷得到最優的混合發酵方式，并進行了相關驗證，結果與預期一致，表明在不同時段添加不同種類的耐鹽酵母發酵結果更優，為企業實際生產高鹽稀態發酵醬油提供了更多的理論依據。今后的研究中將進行不同酵母之間的相互作用分析以及不同株酵母添加不同量時對發酵效果的影響。