兩種不同方法制備達卡巴嗪脂質體的比較研究

王 麗，何 林

(1.四川省南充市中心醫院藥學部，四川 南充 637000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院藥學部，藥物臨床試驗中心，四川 成都 610072)

達卡巴嗪是轉移性黑色素瘤的一線化療藥物[1～3]，在臨床上廣泛用于惡性黑色素瘤的治療。達卡巴嗪臨床使用中也存在一些顯著缺陷，包括劑型單一，穩定性差，患者順應性低，不良反應嚴重，對腦轉移無效等[4～7]。脂質體(Liposome，LP)是由磷脂分散在水中經自組裝形成的雙層或多層封閉囊泡。將脂質體用作藥物載體在腫瘤診療方面受到廣泛關注，用脂質體包封抗腫瘤藥物，與游離藥物相比，療效增強，毒副作用減弱[8～10]。因此，針對達卡巴嗪臨床使用中的問題，我們設想將達卡巴嗪用脂質體進行包封，以期提高達卡巴嗪的療效，降低其不良反應。本研究于2016年7月至2017年7月，以大豆卵磷脂和膽固醇作為原料，依據實驗室條件和預實驗結果，分別選擇了逆向蒸發法和硫酸銨梯度法制備達卡巴嗪脂質體，以包封率為評價指標進行了單因素實驗和正交實驗，以篩選達卡巴嗪脂質體的最佳制備處方和工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器N-1200 A旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社)；SB-1200恒溫水浴鍋(東京理化器械株式會社)；JY92-IIDN超聲波細胞破碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；Universal 320R臺式離心機(德國Hettich科學儀器公司)；UV-1700紫外分光光度儀(日本島津制作所)；BP211D電子天平(德國賽多利斯公司)；動態光散射納米激光粒度儀(Malvern Zetasizer Nano ZS90)；透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

1.2 試藥及材料達卡巴嗪(批號：c02-20161209，蘇州立新制藥有限公司)；大豆卵磷脂(批號：2016012001，成都市科龍化工試劑廠)；膽固醇(批號：2014071401，成都市科龍化工試劑廠)；乙醚(分析純，批號：2016100901，成都市科龍化工試劑廠)；甲醇(色譜純，批號：R141293，規格：4L，成都市科龍化工試劑廠)；硫酸銨(批號：2017010101，成都市科龍化工試劑廠)；MW3500透析袋(中國Bioshap公司)；Amicon? Ultra-0.5 10K 超濾管(默克密理博公司)。

1.3 方法

1.3.1紫外分光光度法測定達卡巴嗪含量 紫外吸收波長的選擇：精密稱取達卡巴嗪2.5 mg，用甲醇于25 ml棕色容量瓶定容，得0.1 mg/ml的達卡巴嗪甲醇溶液，作為儲備液。定量吸取達卡巴嗪儲備液1.6 m于10 m棕色容量瓶，用甲醇定容，得16 μg/ml達卡巴嗪甲醇溶液，在紫外光區200～400 nm作全波長掃描，確定最大吸收波長為324 nm，作為測定波長。

標準曲線的建立：分別取相應體積達卡巴嗪儲備液，于10 ml容量瓶用甲醇定容，配制成濃度為20、16、10、5、2.5、1.25 μg/ml的系列標準溶液。以甲醇溶液為空白，在324 nm波長下測定各濃度的紫外吸收光度值。以達卡巴嗪濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度值為縱坐標建立達卡巴嗪標準曲線，進行線性回歸，回歸方程為y=0.0529x+0.0052，R2=0.9975。

1.3.2脂質體包封率的測定 采用超濾離心法分離脂質體混懸液中的脂質體和游離藥物溶液。取400 μl脂質體混懸液于超濾離心管(濾膜孔徑為10K)中，以6000 r/min離心10 min，外管中超濾液即為未被脂質體包封的游離藥物溶液。取30 μl超濾液，用3 ml甲醇溶解稀釋，用紫外分光光度法測定其達卡巴嗪濃度，即為脂質體混懸液中的游離藥物濃度；取等體積(30 μl)脂質體溶液，3 ml甲醇溶解破乳，同法測定藥物濃度，即為脂質體混懸液中的藥物總濃度。按公式1計算包封率，按公式2計算載藥量。

(公式1)

(公式2)

1.3.3逆向蒸發法制備工藝 精密稱取大豆卵磷脂和膽固醇于圓底燒瓶中，用乙醚溶解，加入達卡巴嗪水溶液，用細胞破碎儀超聲5 min使其乳化，然后減壓旋轉蒸發20 min除去乙醚，逐漸形成凝膠，加入適量磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，繼續旋蒸20 min，使器壁上的凝膠完全脫落，形成濃度適宜的脂質體混懸液，再次用細胞破碎儀超聲，即制得得粒徑均勻的達卡巴嗪脂質體混懸液。

1.3.4單因素實驗 以脂質體包封率為指標，用逆向蒸發法制備達卡巴嗪脂質體，固定其他因素不變，分別考察藥物與磷脂質量比、磷脂與膽固醇質量比、內水相體積、有機相內水相體積比，以及磷脂濃度等處方因素比對包封率的影響，找出影響包封率的主要因素。

1.3.5正交實驗 根據單因素實驗結果，設計正交實驗。以包封率為指標，對實驗結果進行極差分析，所得最佳因素水平組合，即為逆向蒸發法制備達卡巴嗪脂質體的最佳處方。

1.3.6硫酸銨梯度法制備工藝 精密稱取大豆卵磷脂30 mg，膽固醇5.1 mg，加入3 ml乙醚溶解，47 ℃旋轉減壓蒸發成膜后，加入4 ml 0.2 mol/L硫酸銨溶液，47 ℃旋蒸將脂質膜水化成脂質體混懸液，將混懸液用細胞破碎儀探頭超聲(2 s，2 s，5 %，5 min)，即得空白脂質體。將空白脂質體置于透析袋(MW3500)中于400 ml超純水中透析，形成硫酸按梯度。向空白脂質體中加入處方量達卡巴嗪，47 ℃水浴條件下孵育20 min，即得達卡巴嗪脂質體混懸液。

1.3.7實驗篩選處方工藝 本部分實驗每組實驗數據均是平行條件下同時制備3份樣品所測得的平均值。①磷脂膽固醇比的影響：固定其他因素不變，研究磷脂膽固醇摩爾比分別為1∶1，2：1，3∶1時脂質體包封率的變化。②藥脂比及硫酸銨濃度的影響：固定其他因素不變，研究硫酸銨濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L和藥物磷脂質量比分別為1∶30、1∶15、1∶10、1∶7.5時脂質體包封率的變化。③透析液種類的影響：保持其他條件不變，分別研究以純化水，10%蔗糖溶液，磷酸鹽緩沖液(PBS7.4)，0.9% NaCl溶液，5%葡萄糖溶液作為透析液時脂質體包封率的變化。④透析時間的影響：以5%葡萄糖溶液為透析液，固定其他條件不變，研究透析時間長短對脂質體包封率的影響。⑤孵育溫度和時間的影響：保持其他實驗條件不變，在溫度分別為37 ℃、47 ℃、57 ℃水浴條件下孵育10、20、30、40 min進行載藥，測定包封率，確定最佳孵育溫度和時間。

1.3.8達卡巴嗪脂質體的性質表征 采用負染法處理樣品，用透射電子顯微鏡觀察達卡巴嗪脂質體的微觀形態。應用馬爾文動態光散射納米激光粒度儀測定卡巴嗪脂質體的粒徑、分布及Zeta電位值。

2 結果

2.1 逆向蒸發法制備達卡巴嗪脂質體

2.1.1單因素實驗 實驗結果顯示影響包封率的主要因素有藥物磷脂質量比，藥物膽固醇比，有機相與內水相比以及磷脂濃度等4個因素。

2.1.2正交實驗 4個因素分別設置三個水平，見表1。采用L9(34)正交表設計正交實驗，見表2，逆向蒸發法制備達卡巴嗪脂質體的最佳處方見表3。經三次重復驗證實驗，測得該處方制得的脂質體包封率為(28.02±3.11)%，載藥量為(2.71±0.32)%。

表1 正交設計的因素和水平表

表2 正交設計實驗結果

表3 逆向蒸發法最佳處方(n=3)

2.2 硫酸銨梯度法制備達卡巴嗪脂質體

2.2.1磷脂膽固醇比的影響 磷脂膽固醇摩爾比由1∶1增大到3∶1，包封率由35.50%增加到42.90%。若繼續增大磷脂膽固醇摩爾比，考慮到膽固醇比例過低可能會影響脂質體的結構穩定性，故確定硫酸銨梯度法制備脂質體的最終磷脂膽固醇摩爾比為3：1。見圖1。

圖1 磷脂膽固醇摩爾比對包封率的影響

2.2.2藥脂比及硫酸銨濃度的影響 隨著硫酸銨濃度由0.1 mol/L逐漸增加到0.3 mol/L，脂質體包封率呈增大趨勢，當硫酸銨濃度增加為0.4 mol/L，包封率下降，因此確定0.3 mol/L作為硫酸銨梯度法的最佳硫酸銨濃度。在藥物磷脂比的各個水平，隨著藥脂比增大，包封率逐漸下降，在藥脂比為1：10時，包封率最低，藥脂比繼續增大為1：7.5時，包封率開始回升，但繼續增大藥脂比，包封率并未繼續增大。綜合考慮載藥量因素后，選擇藥脂比1∶7.5作為最終藥脂比。見圖2。

圖2 硫酸銨濃度及藥物磷脂質量比對包封率的影響

2.2.3透析液種類的影響 10%蔗糖溶液與5%葡萄糖溶液作透析液的脂質體包封率較高，兩者效果相當。考慮到配制的容易性，選擇了5%葡萄糖溶液作為透析溶液。見圖3。

2.2.4透析時間的影響 隨著透析時間延長，脂質體包封率逐漸增大，透析時間為8小時時，包封率最高，當透析時間增加為10小時，包封率反而降低。故確定透析時間為8 h。見圖4。

圖3 透析液種類對包封率的影響

圖4 透析時間對包封率的影響

2.2.5孵育溫度和時間的影響 在37、47或57 ℃水浴條件下孵育10、20、30或40 min，脂質體包封率無明顯差異。綜合考慮到達卡巴嗪對熱的不穩定性，最終選擇40 ℃作為孵育溫度，20 min作為孵育時間。見圖5。

圖5 孵育時間和溫度對包封率的影響

根據實驗結果確定硫酸銨梯度法制備達卡巴嗪脂質體的最終處方工藝見表4，經三次重復驗證實驗，測得其包封率為(63.67±2.04)%，載藥量為(7.25±0.23)%。綜上，硫酸銨梯度法處方工藝制備的達卡巴嗪脂質體包封率和載藥量均顯著優于逆向蒸發法的最佳處方，故將其作為達卡巴嗪脂質體的最終處方工藝。

2.3 達卡巴嗪脂質體的性質表征外觀及形態：制得的達卡巴嗪脂質體混懸液質地均勻，呈半透明乳白色混懸液，有藍色乳光，無分層，無沉淀。透射電子顯微鏡下脂質體形態如圖6，單個達卡巴嗪脂質體呈規則的球形，外觀圓整，大小均勻。粒徑分布及Zeta電位：脂質體粒徑呈近似正態分布，平均粒徑142.2 nm，多分散指數(polydispersity index，PDI)為0.214，測得其Zeta電位值為-50.4 mV。見圖7。

表4 硫酸銨梯度法的最終處方工藝(n=3)

圖6 透射電鏡下脂質體形態

圖7 達卡巴嗪脂質體粒徑分布

3 討論

有文獻報道達卡巴嗪是脂溶性化合物[11，12]，但實驗顯示其不溶于氯仿、二氯甲烷，乙醚等有機溶劑，達卡巴嗪為親水性化合物。親水性化合物不易被脂質體包封，制得的脂質體包封率普遍偏低，包封率是其處方工藝難點，因此本實驗選取包封率為考察指標。

達卡巴嗪脂質體制備預實驗中，首先嘗試使用薄膜分散法，其包封率始終在10%左右。有文獻報道，逆向蒸發法適用于包裹水溶性藥物和大分子生物活性物質如各種抗生素、胰島素、免疫球蛋白、核酸等[13]，因此嘗試了逆相蒸發法制備達卡巴嗪脂質體，逆向蒸發法是將含藥水溶液(水相)加入到溶有脂材的有機相中進行混合、超聲，形成穩定的 W/O 型乳劑，然后減壓旋蒸除去有機相，形成脂質體混懸液。對逆向蒸發法進行單因素考察，設計正交實驗，獲得最高包封率為(28.02±3.11)%，包封率依然偏低。分析原因可能是在進行減壓旋蒸發形成脂質體混懸液的過程中，含藥水相部分分成了脂質體外水相和內水相兩部分，外水相中的藥物占絕大部分，被脂質體包封于內水相中的藥物只占小部分，所以包封率低。

達卡巴嗪難溶于純水，易溶于酸性水溶液，為弱堿性化合物。將制備方法更換為pH梯度法，結果顯示pH梯度法各處方工藝下制備的脂質體包封率均在10%～30%。硫酸銨梯度法是pH梯度法的衍生方法，適用于弱堿性藥物[14～16]，它是利用硫酸銨水溶液作為水相，然后通過透析使脂質體內水相中的硫酸銨濃度遠大于外水相中硫酸銨濃度。由于 NH4 +解離成 H+和 NH3，NH3跨膜外溢速度遠大于 H+，造成內水相 H+濃度增加，pH 值下降，形成 pH 梯度，產生藥物主動裝載驅動力，使弱堿性藥物主動進入脂質體內水相中，使脂質體包封率較高。將pH梯度法更換為硫酸銨梯度法，包封率有顯著增加，達到了(63.67±2.04)%。

制備高包封率的達卡巴嗪脂質體是課題后續實驗的前提和基礎，找到硫酸銨梯度法后，通過逐步單因素優化使包封率明顯提高，鑒于時間關系，為了不影響后續實驗部分的開展而沒有對硫酸銨梯度法進行正交實驗，這是本實驗的一個缺失和遺憾，正交實驗的開展可能使達卡巴嗪脂質體包封率進一步提高。

對達卡巴嗪脂質體的穩定性也進行了簡單考察，在 4 ℃冰箱冷藏條件下脂質體放置一周后，混懸液外觀無明顯改變，包封率由63.67%下降為52.14%，放置兩周后混懸液的光澤度和通透性下降，包封率進一步下降為46.95%。

綜上，本文以包封率為指標，對比研究逆向蒸發法和硫酸銨梯度法兩種方法制備達卡巴嗪脂質體，最終確定硫酸銨梯度法為達卡巴嗪脂質體的制備方法，篩選出最佳制備工藝，制得的達卡巴嗪脂質體包封率為(63.67±2.04)%，載藥量為(7.25±0.23)%，為后續制備達卡巴嗪長循環脂質體及進一步的藥動學和藥效學研究創造了前提。