糖皮質激素對抗血清剝奪誘導的小鼠肝癌細胞凋亡作用及機制研究

王貴平，曹明月，李高翔，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

(1.西藏大學醫學院，西藏 拉薩 850000；2.中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院藥理學系，北京 100005)

研究表明持續精神應激嚴重影響癌癥的發生、發展及預后[1～4]。精神應激誘導下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)軸活化導致糖皮質激素(glucocorticoids，GCs)釋放，通過作用于糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor，GR)調節腫瘤微環境，進而影響腫瘤的轉歸[5]。GR是一種核激素受體超家族蛋白，細胞質內的GR與糖皮質激素結合后被磷酸化激活，隨后在熱休克蛋白HSP90的協助下轉位至細胞核，與糖皮質激素反應原件(glucocorticoid-response elements，GRE)結合，作為轉錄因子調控靶基因的激活或抑制[5]。在臨床中，糖皮質激素被廣泛用于腫瘤的一線或聯合治療。但是最近的研究顯示，糖皮質激素能誘導化療抵抗、促進腫瘤的侵襲和轉移[6]。因此深入探討糖皮質激素在腫瘤發展過程中的作用及機制，將有利于促進臨床合理應用及發展新型干預策略。本研究以小鼠肝癌細胞系H22為研究對象，血清剝奪誘導H22細胞凋亡并模擬惡性腫瘤增殖過程中低血供狀態，探討內源性糖皮質激素皮質酮(corticosterone，CORT)對腫瘤細胞凋亡的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料本實驗時間為2018年9月至2019年12月。小鼠肝癌細胞系H22源自中國典型培養物保藏中心細胞庫；RPMI-1640培養基和雙抗(青霉素、鏈霉素)購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司；皮質酮(Corticosterone：HBC complex，CORT)購自美國Sigma公司；RU486購自上海陶素生化科技有限公司；Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自東仁化學科技(上海)有限公司；β-actin、GAPDH抗體購自ABclonal公司；GR、Hsp90抗體、辣根過氧化物酶標記馬抗小鼠 IgG二抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗均購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 小鼠肝癌細胞系H22在添加了10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養基中培養，放置于37 ℃、含5% CO2的飽和濕度培養箱中。

1.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡 血清剝奪誘導H22細胞凋亡，同時添加糖皮質及激素CORT及糖皮質激素受體拮抗劑RU486，利用流式細胞術染色檢測細胞凋亡水平變化。取對數增殖期的H22細胞，以5×104cells/ml的細胞密度接種于6孔板中，每孔2 ml培養基。細胞分組為：對照組(10%FBS)、血清剝奪組(0%FBS)、CORT組(0%FBS，添加終濃度為0.25、0.5、1 μmol/L的CORT)、RU486組(0%FBS，添加終濃度為1 μmol/L的RU486)和CORT+RU486組(0%FBS，添加終濃度均為1 μmol/L的CORT和RU486)。血清剝奪及CORT或RU486給藥處理24 h后收集細胞，用Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡水平變化。具體實驗步驟參照試劑盒說明書和參考文獻[7]。即：1000 rpm室溫離心5 min，棄上清，PBS洗2次，加入適量1×染色結合液重懸細胞，計數后調整細胞濃度至1×106cells/ml，每100 μl細胞懸液添加5 μl FITC-Annexin V抗體和5 μl PI染液，室溫避光孵育15 min，加入400 μl 1×染色結合液。1 h內用BD AccuriTM C6流式細胞儀檢測各組細胞凋亡比例。實驗結果用FlowJo 10.5.3軟件進行分析。

1.2.3蛋白質免疫印跡檢測GR和Hsp90蛋白表達水平 取對數增殖期的H22細胞，以8×104cells/mL的細胞密度，10 ml RPMI-1640培養基(含10%FBS)，接種于100 mm細胞培養皿。將細胞分為對照組組和CORT組。對照組不給藥，CORT組添加終濃度為1 μmol/L的CORT。48 h后收集細胞，提取細胞各組分蛋白后進行蛋白質免疫印跡實驗檢測Hsp90和GR蛋白表達，具體實驗步驟為：細胞中添加適量胞質蛋白提取緩沖液，4 ℃ 4200 g離心5 min，收集上清，即為胞質蛋白；細胞沉淀重懸于適量可溶性核蛋白提取緩沖液，冰上孵育30 min，4 ℃，5000 g離心5 min，收集上清，即為可溶性核蛋白；細胞沉淀重懸于適量染色質結合核蛋白提取緩沖液，隔水超聲，4 ℃，5000 g離心5 min，收集上清，即為染色質結合核蛋白。BCA法蛋白定量并調整至相同蛋白濃度后進行蛋白質免疫印記實驗，于80 V恒壓凝膠電泳3 h，100 V、2 h恒壓電轉至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃過夜孵育GR和Hsp90一抗，室溫1 h孵育二抗。按照說明書均勻孵育ECL顯影液后用天能化學發光成像儀曝光并拍照。使用軟件Gel-Pro analyzer分析各蛋白條帶灰度值，以目標蛋白/內參蛋白條帶灰度值表示相對蛋白表達，采用百分比歸一化法統計分析組間蛋白表達差異。

1.3 統計學方法采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件。計量資料用均值±標準差表示，組間比較進行方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 皮質酮對血清剝奪誘導的H22細胞凋亡的影響與對照組比較，血清剝奪后H22細胞凋亡水平顯著升高(P<0.01)；與血清剝奪組相比，0.25、0.5和1.0 μmol/L CORT處理后，H22細胞凋亡比例顯著降低(P<0.05)，并呈現劑量依賴性，依次為48.51%、48.28%和38.44%；CORT和GR拮抗劑RU486共處理后，H22細胞凋亡水平與1.0 μmol/L CORT組相比顯著升高(P<0.05)，凋亡比例回升至75.94%。見圖1。

2.2 皮質酮上調GR和Hsp90的水平與對照組相比，CORT組H22細胞與染色質結合核蛋白中GR表達水平升高了2.15倍，胞漿蛋白和可溶性核蛋白中Hsp90蛋白表達分別升高了1.62倍和1.65倍。見圖2。

圖1 各組H22細胞凋亡流式結果圖 a：凋亡流式結果圖；b：各組凋亡比例比較；c：晚期凋亡比例

圖2 各組H22細胞蛋白質免疫印跡分析 a：蛋白免疫印跡結果；b：GR相對水平；c：HSP相對表達水平

3 討論

由于血管發育不完善，在腫瘤組織內部很多區域處于營養缺乏狀態，因而實體腫瘤的生長對血液供應具有很大的依賴性。當血供不足時，腫瘤細胞將啟動一系列的細胞信號轉導途徑，促進腫瘤細胞發生凋亡。基礎和臨床研究均揭示了慢性精神應激可以通過激活HPA軸促進腫瘤的發生和發展，提示糖皮質激素在增強腫瘤細胞應對不利環境可塑性方面發揮著重要作用。糖皮質激素曾經作為一線藥物用于白血病等腫瘤治療[8]，但是最近的研究發現，糖皮質激素能促進乳腺癌轉移[6]，表明糖皮質激素可能參與腫瘤的發生發展過程，但相關機制尚待闡明。本研究以小鼠肝癌細胞系H22為研究對象，探究糖皮質激素對血清剝奪條件下腫瘤細胞凋亡的影響及相關機制。采用血清剝奪模擬實體腫瘤生長過程中的低血供狀態以誘導H22細胞凋亡。在血清剝奪條件下，利用糖皮質激素CORT及糖皮質激素受體拮抗劑RU486體外給藥來探討糖皮質激素對H22細胞凋亡的影響。已有研究表明Hsp90作為一種分子伴侶，參與協助GR的核轉位[9]，因此本研究進一步對正常血清培養條件下CORT處理后GR核轉位和Hsp90的表達水平進行了分析。實驗結果顯示，皮質酮顯著抑制血清剝奪誘導的H22細胞凋亡，并促進H22細胞中GR核轉位以及升高Hsp90蛋白表達水平。

綜上所述，本研究發現糖皮質激素可以抵抗血清剝奪誘導的肝癌細胞H22的凋亡，其機制可能與Hsp90協助下增強的GR核轉位有關。研究結果為慢性精神應激下癌癥發生發展復雜的機制研究提供新的視角，并為臨床癌癥患者治療中糖皮質激素的合理用藥提供參考依據。但是本研究僅在體外進行，未在動物體內做驗證。后續將建立慢性精神應激小鼠腫瘤模型，系統評價糖皮質激素以及GR核轉位對腫瘤生長的作用，系統研究GR下游靶基因SGK1等的作用以明確其在腫瘤發生發展中的作用。