肺腺癌組織中抑微管裝配蛋白1和葡萄糖調節蛋白78的表達情況及與患者臨床特征的關系

胡星明，陳躍軍，王子堯，方理，周彬，吳安邦，肖高明

湖南省腫瘤醫院/中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院胸外科，長沙 410005

肺腺癌是一種非小細胞肺癌，非小細胞肺癌約占全部肺癌的80%，其中約50%是肺腺癌[1]。肺腺癌是女性亞洲人和45歲以下人群中最常見的肺癌類型，而且更可能發生于非吸煙者，遺傳、被動吸煙等也可能是病因。有報道顯示，肺腺癌發生的分子改變包括ALK[2-3]、ROS1[4-5]、RET[6-8]基因重排以及EGFR、HER2、KRAS、ALK、BRAF、PIK3CA、MET基因突變。由于腫瘤信號通路較為復雜，因此仍有大量的研究工作需要進行。有研究報道，抑微管裝配蛋白 1（stathmin 1，STMN1）是細胞質磷酸化蛋白，可以調節微管動力學，與腫瘤發生發展和微管結合抗癌藥物的耐藥性有關[9]。不同的細胞外信號能夠導致不同的磷酸化類型，如乳腺癌中STMN1 Ser25和Ser38磷酸化是維持細胞運動所必須的，與患者的無瘤生存期較短有關。葡萄糖調節蛋白 78（glucose-regulated protein 78，GRP78）是一種新型Ser25/Ser38磷酸化STMN1結合蛋白，這種依賴磷酸化的相互作用受甲乙酮（methyl ethyl ketone，MEK）激酶調節和STMN1-GRP78復合物穩定性及STMN1介導的遷移所影響。磷酸化STMN1和GRP78也被認為可評估乳腺癌的轉移風險。有報道顯示，STMN1高表達與食管鱗狀細胞癌、肺腺癌、子宮內膜癌的預后差有關，而GRP78也與一些藥物作用有關[10]。本研究分析了肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達情況及與患者臨床特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年1月1日至2015年12月31日于湖南省腫瘤醫院胸外科接受手術治療的肺腺癌患者。納入標準：術前均未接受過化療、放療等治療；術前經支氣管窺鏡或腫塊穿刺標本病理檢查確診為肺腺癌。排除標準：合并其他類型肺癌；合并其他器官惡性腫瘤；腫瘤已轉移。依據納入和排除標準，本研究共納入51例肺腺癌患者，其中，男37例，女14例；年齡為44～72歲，中位年齡為59歲。收集肺腺癌患者的肺腺癌組織51例。同時選取27例正常肺組織作為對照，包括肺良性病變組織18例和癌旁正常肺組織9例。其中，男20例，女7例；年齡為43～71歲，中位年齡為58歲。51例肺腺癌組織與27例正常肺組織對應患者的性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑

GRP78 BiP抗體和STMN1抗體均購自美國Abcam公司，工作液濃度均為1∶100。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色試劑盒及相應二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學染色方法

石蠟切片常規脫蠟脫水，3%過氧化氫孵育20min，PBS沖洗后，置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中微波處理進行抗原修復，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加封閉血清，37℃孵育20 min，滴加一抗，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次5 min；DAB溶液顯色；自來水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組織化學染色結果判定標準

STMN1和GRP78陽性細胞表現為細胞膜或細胞質中出現棕黃色顆粒。由病理科高級醫師對免疫組織化學染色結果進行評價。依據陽性細胞百分比評分：0%～4%的陽性細胞記為0分，5%～25%的陽性細胞記為1分，26%～50%的陽性細胞記為2分，51%～75%的陽性細胞記為3分，＞75%的陽性細胞記為4分。依據染色強度評分：無染色或邊緣染色記為0分，淺黃色記為1分，黃色記為2分，棕褐色記為3分。陽性細胞百分比評分與染色強度評分相加，0分記為（-），1～4分記為（+），5～8分記為（++），9～12分記為（+++），其中0分為陰性，其余為陽性。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計分析。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關分析法進行相關性分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌組織及正常肺組織中STMN1和GRP78的表達情況

STMN1和GRP78陽性表達呈棕黃色（圖1）。肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率分別為66.7%（34/51）和60.8%（31/51），分別明顯高于正常肺組織的18.5%（5/27）和22.2%（6/27），差異均有統計學意義（χ2=16.370、10.528，P＜0.01）。肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達呈正相關（r=0.455，P＜0.05）。

圖1 肺腺癌組織和正常肺組織中STMN1和GRP78的表達情況（免疫組織化學染色，×20）

2.2 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78表達情況的比較

不同性別、年齡、淋巴結轉移情況肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=9.82、8.56，P＜0.05）。不同分化程度、TNM分期肺腺癌患者肺腺癌組織中GRP78的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（χ2=14.89、13.65，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達情況（n=51）

3 討論

本研究對肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達情況及臨床意義進行了初步研究。結果顯示，肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率分別為66.7%和60.8%，分別明顯高于正常肺組織的18.5%和22.2%，差異均有統計學意義（P＜0.01），且肺腺癌組織中STMN1和GRP78的表達呈正相關（r=0.455，P＜0.05）。提示STMN1和GRP78可能與肺腺癌的發生有關。研究報道顯示STMN1在多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的發生有關[11]。研究表明，STMN1高表達與食管鱗狀細胞癌的浸潤深度、淋巴結轉移、淋巴管浸潤和靜脈侵犯有關，STMN1高表達患者的生存率低于STMN1低表達患者，STMN1高表達與新輔助放化療的反應性差有關，抑制STMN1的表達可增強食管鱗狀細胞癌對放化療的敏感性[12]。

本研究結果還顯示，不同性別、年齡、淋巴結轉移情況肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同分化程度、TNM分期肺腺癌患者肺腺癌組織中STMN1和GRP78的陽性表達率比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。分化程度越低，STMN1和GRP78的陽性表達率越高；臨床分期越晚，STMN1和GRP78的陽性表達率越高。有一些研究支持這些結果，如抑微管裝配蛋白（stathmin）過表達與淋巴管浸潤、分期晚、生存率低有關[13]。有報道認為血清stathmin水平是肺癌尤其是進展期和有淋巴結轉移的肺腺癌的潛在生物標志物[14]。stathmin表達情況與子宮內膜癌患者的無瘤生存期和總生存期顯著相關[15]。研究發現，下咽鱗狀細胞癌組織中STMN1表達水平明顯升高，且其表達水平與分化程度、臨床分期、腫瘤體積、淋巴結轉移及生存率等因素有關；體外實驗表明，STMN1能夠促進下咽鱗狀細胞癌細胞的增殖和遷移，且與上皮-間充質轉化有關[16]。另有研究表明，口腔鱗狀細胞癌中stathmin過表達，且其表達情況與性別、TNM分期、分化程度、生存期、淋巴結轉移情況有關[17]。STMN1也在膽囊癌的發生和發展中發揮重要作用[18]。

關于GRP78與肺腺癌關系的研究較少，有報道認為該分子參與一些化學物質的抗腫瘤作用。如血根堿和淫羊藿苷均具有抗肺腺癌的作用，研究發現二者的作用均涉及內質網應急相關分子如GRP78的表達改變[19-20]。伴侶蛋白L-異天冬氨酸（D-天冬氨酸）O-甲基轉移酶的高表達出現在晚期肺腺癌患者中，與GRP78調節的內質網應激有關，提示預后差[21]。有研究顯示，STMN1在肝癌、膠質瘤、胰腺癌等惡性腫瘤中癌基因作用的發揮受多種微小RNA（microRNA，miRNA）的調控，表明在肺腺癌中可能存在其他機制調控STMN1的表達[22]。此外，CDC2蛋白抑制劑purvalanol A可通過癌蛋白18（oncoprotein 18，Op18）/stathmin信號通路增強紫杉醇的毒性作用[23]。

綜上所述，STMN1和GRP78的高表達與肺腺癌的發生發展密切相關，可能是肺腺癌發生中的重要信號分子。