上海虹口區(qū)2017-2019 年致瀉性大腸埃希菌耐藥和分子分型(PFGE)研究

倪春苗 張靜 沈靜 金宏飛 唐漪靈 王姍

（上海市虹口區(qū)疾病預(yù)防控制中心 上海 200080）

致瀉性大腸桿菌是一種重要的腹瀉病病原菌，主要包括腸粘附性大腸桿菌（EAEC），出血性大腸桿菌（EHEC），產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC），致病性大腸桿菌（EPEC），侵襲性大腸桿菌（EIEC），由它們引起的各類腹瀉很大程度地影響著的人類健康，而一旦疏于監(jiān)控，暴發(fā)嚴(yán)重疫情，會對公共衛(wèi)生造成巨大威脅。為此，現(xiàn)將2017 年—2019 年上海市虹口區(qū)分離到的致瀉性大腸桿菌進(jìn)行脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)分型及藥敏性分析，通過其PFGE 型別特征和耐藥特點，為臨床用藥和制定有效防控措施提供依據(jù)。

1.方法與實驗

1.1 樣品來源

醫(yī)院根據(jù)《上海市腹瀉病監(jiān)測試點實施方案》，采集標(biāo)本后，保存于Cary-Blair 運送培養(yǎng)基，按生物安全運送要求于采樣當(dāng)天送至監(jiān)測實驗室。

1.2 試劑與儀器

麥康凱培養(yǎng)基(科馬嘉)；雙糖(科馬嘉)；檢測試劑盒：腸粘附性大腸桿菌（EAEC），出血性大腸桿菌（EHEC），產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC），致病性大腸桿菌（EPEC），侵襲性大腸桿菌（EIEC）檢測試劑盒，（之江生物有限公司）藥敏板：革蘭氏陰性菌藥敏板GN4F（ThermoFisher）蛋白酶K(TaKaRa)；限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ（TaKaRa）

PCR 儀：宏石實時熒光PCR；水浴培養(yǎng)箱(天能科技)；濁度儀(法國生物梅里埃)；生物安全柜(美國Baker)；GFL 型水浴搖床；凝膠成像系統(tǒng)和PFGE及配套設(shè)備(美國Bio-Rad公司)。全自動微生物藥敏鑒定儀（Sensititre）

1.3 致瀉性大腸埃希菌檢測、分離及鑒定參照《上海市腹瀉病監(jiān)測試點實施方案》

標(biāo)本直接麥康凱（MAC）平板上，36 度培養(yǎng)18 ～24h，挑取5 個可疑菌落進(jìn)行生化初篩。生化初篩符合后進(jìn)行熒光定量PC R檢測(上海之江科技公司)確證實驗。；反應(yīng)體系：檢測混合液35μl，酶0.4μl，H2O1μl,樣品4μl。條件：37℃2m，94℃2m，再按93℃15s ～60℃s，進(jìn)行40 個循環(huán))，反應(yīng)體系40μl。實驗結(jié)果判定按照檢測試劑盒說明書。PFGE 分型按照美國CDC PulseNet 制定的PFGE 標(biāo)準(zhǔn)，沙門標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812 作為分子質(zhì)量標(biāo)記，選用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ進(jìn)行酶切。PFGE 圖像用BioNumerics 軟件根據(jù)UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析。實驗參數(shù)：電壓梯度6V/cm，電場夾角120°，脈沖時間6.76 ～35.38s，電泳時間18±1h。

1.5 藥敏檢測

確認(rèn)致瀉性大腸桿菌的菌株進(jìn)行肉湯增菌，用比濁儀調(diào)到0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬谌詣铀幟翳b定儀上按照操作規(guī)程完成加樣、判讀.

2.結(jié)果

2.1 致瀉性大腸在2017 年送檢318 份樣品，2018 年133 份樣品2019 年10 為止是170 份，一共為621 份。在這些感染性腹瀉患者糞便標(biāo)本中，檢出85 株致瀉性大腸，檢出率為13.68%，其中EPEC（30 株）ETEC(41 株)和EAEC(14 株)。

2.2 對80 株菌株做了PFGE 分子分型檢測、

其中2017 年44 株，2018 年5 株（2018 年收集的菌株樣本比較少，）2019 年31 株。在2017 年出現(xiàn)2 株ETEC 菌株100%的聚類和2019 年出現(xiàn)了2 株EAEC 菌株100%的聚類。其他每個帶型僅有1 株菌。PFGE 條帶型相似性60%～ 100% 分型結(jié)果表明本區(qū)致瀉性大腸呈高度多態(tài)性。如圖1

2.3 對60 株菌株做了藥敏檢測，采用了MIC 法

共做了24 種抗生素的藥敏實驗，致瀉性大腸桿菌對美羅培南（MEM）、亞胺培南(IMP)、阿米卡星（AMI）多粘菌素E和B（CT、PB）完全敏感；對氨芐西林（AMP）、四環(huán)素（TET）耐藥率高分別為70%和60%，對頭孢烯類抗生素(CTX、CEC、CFX、CAZ)中、只有22.%的菌株對CFZ 耐藥，其他均敏感。對氨基糖苷類抗生素(KAN、GEN)絕大多數(shù)菌株敏感。

3.討論

3.1 在621 份糞便標(biāo)本中，檢出85 株致瀉性大腸，檢出率為13.68%，與國內(nèi)相關(guān)報道基本符合[1-2]。

3.2 近年來，由于抗生素的廣泛使用，致瀉性大腸桿菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，已經(jīng)出現(xiàn)了許多多重耐藥菌株[3]而虹口地亞安培南（IMI）、美羅培南（MEM）、阿米卡星（AMI）多粘菌素E 和B（CT、P B）完全敏感；孢烯類抗生素(C TX、CEC、CFX、CAZ)中、只有22.%的菌株對CFZ 耐藥，其他均敏感。對氨芐西林（AMP）、四環(huán)素（TET）耐藥率高分別為70%和60%，對氨基糖苷類抗生素(KAN、GEN)絕大多數(shù)菌株敏感（這與一些地區(qū)報道不一致）[4]。所以由致瀉性大腸桿菌引起的腹瀉中，在治療過程中應(yīng)結(jié)合《抗菌藥物臨床應(yīng)用指導(dǎo)原則》和本地區(qū)該菌耐藥特點進(jìn)行選擇，以減少耐藥株的產(chǎn)生。

3.3 80 株大腸桿菌出現(xiàn)78 個PFGE 帶型，表明虹口區(qū)致瀉性大腸帶型呈現(xiàn)高度多態(tài)性，這與其他地區(qū)情況一致[5].其中在2017 年和2019 年中分別出現(xiàn)兩株P(guān)FGE 帶型中100%的聚類情況，并且耐藥性也很相近，提醒相關(guān)部門關(guān)注，可能會引起小規(guī)模的暴發(fā)。。

3.4 通過藥敏實驗和PFGE 建立本地區(qū)的致瀉性大腸桿菌基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合臨床特征、流行病學(xué)調(diào)查，深入認(rèn)識虹口地區(qū)致瀉性大腸桿菌分群特征及整體狀況，對本地區(qū)致病性的大腸桿菌長期監(jiān)測、耐藥情況的發(fā)現(xiàn)、指導(dǎo)臨床用藥及疫情的預(yù)測預(yù)防等工作具有重要價值。